Mdivi-1對順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞活性氧產(chǎn)生及凋亡的影響

危永芳，董佳瑤，吳沁璇，周碧蘭，吳昭全

（長沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖南長沙 410219）

急性淋巴細(xì)胞白血病是造血系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，死亡率高，化療是其主要的治療手段之一。順鉑作為第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于腫瘤治療的鉑類藥物，通過干擾細(xì)胞內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1]，廣泛用于各種腫瘤的治療。線粒體作為細(xì)胞“動力工廠”，其功能的維持對保證細(xì)胞正常運轉(zhuǎn)具有重要意義。線粒體是高度動態(tài)變化的，能不斷地進(jìn)行分裂和融合，該平衡的維持是保證線粒體正常生理功能的重要基礎(chǔ)[2]。線粒體動力相關(guān)蛋白（Drp1）作為一種重要的線粒體分裂蛋白，其過表達(dá)可促使線粒體分裂增多，導(dǎo)致線粒體呈顆粒狀。線粒體是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的主要來源，Johanna等[3]的研究表明，較高水平的ROS與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。而正常的線粒體形態(tài)對于維持細(xì)胞內(nèi)ROS水平具有重要作用。本文通過研究Mdivi-1（一種Drp1抑制劑）對順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞ROS產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡的影響，探討Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂與順鉑抗白血病作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（北京TransGen Biotech公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青霉素/鏈霉素抗生素（美國Gibco公司）；Mdivi-1（美國Sigma公司）；順鉑（西亞試劑）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京四正柏公司）；活性氧檢測試劑盒（美國Sigma公司）。

Guava easyCyte HT 流式細(xì)胞儀（美國 Millipore公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；SW-CJ-2FD超凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Legend micro 17小型臺式離心機(jī)（美國Thermo公司）；單道移液槍（德國Brand公司）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

L1210細(xì)胞株購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），用含1%雙抗、10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 ROS檢測

取對數(shù)生長期的L1210細(xì)胞，接種于6孔板中，分為對照組、DDP處理組、Mdivi-1+DDP處理組。DDP處理組加入400mg/mL的順鉑，Mdivi-1+DDP處理組加入5μmol/L的Mdivi-1預(yù)處理lh，再加入400mg/mL的順鉑，處理48 h；收集細(xì)胞，棄上清，用1 μmol/L的DCFH-DA探針1 mL重懸細(xì)胞。37℃避光孵育20min，PBS洗兩遍，將樣品加入圓底96孔板中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期的L1210細(xì)胞，接種于6孔板中，按1.3項分組處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，取 100 μL 細(xì)胞懸液，加入 5 μL Annexin V/FITC和10 μL20 μg/mL的PI溶液混勻，避光處理15 min 后，加 400 μLPBS，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mdivi-1對順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞中ROS的調(diào)控

如圖1所示，與對照組相比，DDP處理組熒光信號明顯增強(qiáng)，提示ROS水平增高，而5μmol/L Mdivi-1預(yù)處理可明顯降低順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，但不能完全阻止活性氧的增加。該結(jié)果表明，Drp1可通過介導(dǎo)線粒體分裂來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，該過程可能與順鉑的抗白血病作用有關(guān)。

圖1 不同處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.2 Mdivi-1對順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對照組相比，DDP處理組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，而5μmol/L的Mdivi-1預(yù)處理組，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，說明Mdivi-1對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有明顯抑制。而Mdivi-1為Drp1的抑制劑，該結(jié)果提示Drp1參與了順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡。

圖2 Mdivi-1對順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡的影響

3 結(jié)論與討論

順鉑通過與DNA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，干擾DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用。線粒體作為細(xì)胞能量供應(yīng)的主要場所，近年來線粒體動力學(xué)一直是細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點，其運行情況對細(xì)胞及機(jī)體都至關(guān)重要。線粒體分裂和融合雖然不是同時進(jìn)行，但卻高度協(xié)調(diào)，平衡一旦被打破常常會導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，而高水平的活性氧可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究顯示，順鉑可誘導(dǎo)L1210細(xì)胞ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡，而Mdivi-1預(yù)處理會顯著抑制順鉑誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了Drp1抑制劑Mdivi-1對順鉑誘導(dǎo)的caspases-3活化和細(xì)胞凋亡有抑制作用[4]。綜合這些研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂與順鉑的抗白血病作用息息相關(guān)，但其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究探索。此外，順鉑耐藥性的產(chǎn)生是限制其臨床應(yīng)用的重要原因。有研究顯示線粒體動態(tài)變化與順鉑耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)[5]，而關(guān)于這方面的研究還需要進(jìn)行深入的探索。