蔓三七葉多糖的柱層析純化及理化性質研究

李華勇，胡居吾

（1.江西省吉安市食品藥品檢驗檢測中心，江西吉安 343000；2.江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）

蔓三七，又名平臥菊三七，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸等成分，多利用其消炎止咳、通經(jīng)活絡、消腫止痛，可用于治療肺結核、支氣管肺炎等[1]?，F(xiàn)代生物化學和醫(yī)學研究證明，蔓三七具有消炎止咳，散淤消腫等功效[2]，還具有提高人體免疫力、改善機體免疫功能的作用[3]，降血糖、降血壓和抑制乙型肝炎的顯著效果[4]。蔓三七又和木耳菜同屬，食味柔滑，清香可口，具有極好的營養(yǎng)價值；可清炒、涼拌、氽湯，其葉也可生吃，或取鮮葉開水沖泡當茶飲，具有較高的經(jīng)濟價值。其中含有的多糖具有復雜的化學結構及豐富的生物活性，包括抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抑制血管生成[7]、抗感染[8]、改善免疫功能[9]、調(diào)節(jié)血糖血脂[10]、保肝[11]等多種功效。

植物多糖經(jīng)提取后，提取液中常含有蛋白質、色素、單糖、無機鹽和各種小分子雜質，需要對粗多糖進行分離純化。由于色素、小分子雜質在原料預處理（石油醚脫脂、乙醇浸泡）和醇沉過程中幾乎被除去，因此除蛋白是多糖純化過程中的重要環(huán)節(jié)，常用除蛋白的主要方法為Sevage法、木瓜蛋白酶法、三氯乙酸法等[12-13]。為了獲得純多糖組分，還需通過色譜柱法或分級沉淀法對除蛋白多糖進一步分離。

本研究采用三氯乙酸法對蔓三七葉粗多糖進行除蛋白，并利用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-75葡聚糖凝柱對除去蛋白的蔓三七葉多糖分離純化，同時對純化后的蔓三七葉多糖的理化性質進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓三七葉，購買自江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，烘干、粉碎后過20目篩備用。

三氯乙酸、考馬斯亮藍G-250、碘化鉀、牛血清蛋白、氯化鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；纖維素填料 DEAE-52、葡聚糖凝膠G-75均為索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設備

DZF-6090Z型真空干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FD-1C-50冷凍干燥機，上海豫明儀器有限公司；層析柱（3 cm×30 cm），上海滬西分析儀器廠；CTO-20A柱溫箱、RLO-10Z示差折光檢測器，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蔓三七葉粗多糖的提取

取烘干、粉碎后的蔓三七葉，按料液比1∶15加入蒸餾水，于65 ℃恒溫水浴2.5 h，離心、抽濾，濾渣部分繼續(xù)用同樣方法浸提，上清液合并濃縮后緩慢加入4倍體積的無水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃低溫靜置24 h，再以 4 800 r/min 離心 10 min，收集下層粗多糖沉淀，最后用無水乙醇洗滌2次，沉淀物用65 ℃超純水溶解、備用[14]。

1.3.2 蔓三七葉粗多糖中蛋白的去除

1.3.2.1 蛋白去除

采用三氯乙酸法除去蔓三七葉粗多糖中的蛋白質。將1.3.1下提取的蔓三七葉粗多糖溶解于蒸餾水并置于冰浴中，緩慢加入15%的三氯乙酸，不斷攪拌直至溶液的pH為2～3，4 ℃下保持1 h，以達到蛋白質與多糖分離的效果。將溶液取出，離心15 min，收集上清液，濃縮，冷凍干燥得蔓三七葉除蛋白多糖樣品[15]。

1.3.2.2 除蛋白多糖中蛋白質含量的測定

參照考馬斯亮藍法并稍作修改。配置0.1 mg/mL的牛血清蛋白溶液，分別稱取 0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL至7個試管中，依次加蒸餾水補充到1 mL，再分別加入5 mL考馬斯亮藍試劑，立即搖勻，靜置10 min。以第1只試管中的溶液作參比，測定595 nm處的吸光度，繪制牛血清蛋白溶液和吸光度的標準曲線。

將多糖樣品配置成一定濃度，取1 mL按照上述操作測定樣品中蛋白質含量。根據(jù)公式1和公式2計算蛋白質去除率和多糖保留率。

1.3.3 蔓三七葉多糖的DEAE-52纖維素柱層析

1.3.3.1 DEAE-52纖維素的預處理及裝柱

將干燥的DEAE-52纖維素用蒸餾水浸泡24 h，使其充分溶脹，并不斷攪拌以除去泡沫和雜質。將溶脹好的DEAE-52纖維素放置于0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min，反復用蒸餾水洗至中性；再將堿處理后的DEAE-52纖維素置于0.5 mol/L的HCl溶液中浸泡30 min，用蒸餾水洗至中性，最后再置于0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min，蒸餾水洗至中性備用[12]。將預處理好的DEAE-52纖維素用適量蒸餾水溶解，攪拌均勻，緩慢地倒入層析柱（3.0 cm×30 cm），盡量避免裝柱過程產(chǎn)生氣泡，必要時可進行加壓裝填。為了使柱料穩(wěn)定，需用蒸餾水平衡過夜。

1.3.3.2 多糖的DEAE-52纖維素柱層析

準確稱取200 mg去除蛋白的蔓三七葉多糖樣品，用極少量的蒸餾水溶解。將溶解的蔓三七葉多糖樣品用膠頭滴管沿著層析柱壁緩慢加入，待樣品進入柱層析穩(wěn)定后，依次用蒸餾水和NaCl溶液（0.05 moL/L、0.10 moL/L、0.20 moL/L）以 1 mL/min的流速進行洗脫。每管收集5 mL，并通過苯酚-硫酸法對每管中多糖的含量進行監(jiān)測，繪制洗脫管數(shù)和吸光度值的洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線的峰形，分別收集洗脫液。然后對洗脫液進行濃縮、冷凍干燥，獲得初步分離的蔓三七葉多糖組分，進行下一步SephadexG-75葡聚糖凝膠柱層析分離研究[15]。

1.3.4 蔓三七葉多糖的Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析

1.3.4.1 Sephadex G-75葡聚糖凝膠的預處理及裝柱

將干燥的Sephadex G-75葡聚糖凝膠粉末用蒸餾水煮沸3 h，使其充分溶脹。采用濕法裝柱，將預處理好的葡聚糖凝膠用適量蒸餾水溶解并攪拌均勻，緩慢地倒入層析柱（3.0 cm×50 cm），避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡和流干水分。裝好的層析柱用蒸餾水平衡過夜。

1.3.4.2 蔓三七葉多糖的Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析

將通過DEAE-52纖維素柱收集到的蔓三七葉多糖組分溶解于蒸餾水，并利用膠頭滴管沿柱壁緩慢加入，待樣品溶液穩(wěn)定后，用蒸餾水以0.5 mL/min的流速進行洗脫。每管收集2 mL，共收集60管。再次用苯酚-硫酸法進行檢測，繪制洗脫曲線。收集蔓三七葉多糖含量較高的組分，濃縮、冷凍干燥獲得蔓三七葉純多糖組分[15]。

1.3.5 蔓三七葉純多糖理化性質的測定

1.3.5.1 物理狀態(tài)檢測

對蔓三七葉純多糖的顏色、形態(tài)以及溶解性進行觀察。

1.3.5.2 化學檢測

考馬斯亮藍試驗：參照1.3.2.2蛋白質含量的測定方法，將蔓三七葉純多糖組分用蒸餾水溶解，加入5 mL考馬斯亮藍，混合均勻后觀察其顏色變化。

苯酚-硫酸試驗：參照胡居吾等[14]測定多糖含量的方法，將蔓三七葉純多糖組分用蒸餾水溶解，加入1 mL苯酚，再緩慢加入濃硫酸，混合后觀察顏色變化，并測定其多糖含量。

碘化鉀試驗：將蔓三七葉純多糖組分用蒸餾水溶解，加入幾滴碘-碘化鉀溶液，觀察其顏色變化，判斷是否為淀粉類多糖[16]。

2 結果與分析

2.1 粗多糖中蛋白質去除率的測定

2.1.1 蛋白質標準曲線

以牛血清蛋白標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作標準曲線，結果如圖1所示?；貧w方程y=7.794 5x+0.065 6（R2=0.999 7）。

圖1 蛋白質標準曲線

2.1.2 粗多糖蛋白質去除率

蔓三七葉粗多糖被三氯乙酸除蛋白后，多糖中大部分蛋白質已被除去。經(jīng)計算，蔓三七葉粗多糖中的蛋白質去除率為93.35%，蔓三七葉粗多糖保留率為84.27%。

2.2 DEAE-52纖維素柱純化結果

從洗脫曲線（圖2）可以看出，在本試驗洗脫條件下得到4個洗脫峰，分別是以蒸餾水及0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.20 mol/L 的 NaCl溶液洗脫得到。這是由于蔓三七葉多糖在以蒸餾水作洗脫溶液時，有些不帶電多糖或者帶有很弱的負電荷多糖不能被DEAE-52纖維素吸附或者吸附很弱，首先隨著蒸餾水洗脫下來，即是圖中的第1個洗脫峰。而多糖中帶有負電荷的部分，被DEAE-52纖維素所吸附，必須用比DEAE-52纖維素吸附更強的Cl-、OH-來洗脫，才能將這部分蔓三七葉多糖洗脫下來。由圖2洗脫曲線可以看出，在以不同濃度NaCl洗脫時均能得到或高或低的洗脫峰，考慮到節(jié)省時間和節(jié)約成本等因素，選取第1個峰位置與第4個峰位置進行收集，即分別以蒸餾水和0.2 mol/L的NaCl溶液作為洗脫液，洗脫下的多糖分別為蔓三七葉中性多糖（GPLP-D1）和蔓三七葉酸性多糖（GPLP-D2）。

圖2 DEAE-52洗脫曲線

2.3 Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析洗脫

蔓三七葉多糖組分中性多糖（GPLP-D1）和蔓三七葉酸性多糖（GPLP-D2）分別經(jīng)過Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析的洗脫結果如圖3a和圖3b所示。由圖3a和圖3b可知，蔓三七葉中性多糖（GPLP-D1）和蔓三七葉酸性多糖（GPLP-D2）經(jīng)蒸餾水洗脫后均出現(xiàn)單一的吸收峰，分別收集兩種洗脫液，濃縮、冷凍干燥后分別得到蔓三七葉中性純多糖（GPLP-S1）和蔓三七葉酸性純多糖（GPLP-S2）。

圖3 Sephadex G-75 洗脫曲線

2.4 GPLP-S1和GPLP-S2理化性質的測定

GPLP-S1和GPLP-S2的理化性質如表1所示。GPLP-S1和GPLP-S2均為白色粉末，都易溶于水，不易溶于乙醇、丙酮等有機試劑。GPLP-S1、GPLP-S2與苯酚-硫酸反應后均顯示出多糖成分，與考馬斯亮藍和碘化鉀反應后顏色均無明顯改變，表明兩種多糖是非淀粉多糖且不含蛋白質，多糖純度分別為91.65%和92.06%。

3 結論

本研究首先在最佳條件下對蔓三七葉粗多糖進行提取，然后采用三氯乙酸法除蛋白，再通過DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析進一步分離純化，最后測定了蔓三七葉純多糖組分GPLP-S1和GPLP-S2的理化性質。主要結論如下：

（1）經(jīng)過三氯乙酸除蛋白后，蔓三七葉多糖中蛋白質去除率為92.35%，多糖保留率為82.74%，表明蔓三七葉多糖中的蛋白質可通過三氯乙酸法除去。

表1 GPLP-S1和GPLP-S2理化性質

（2）蔓三七葉粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析分離純化后得到純多糖組分GPLP-S1和GPLP-S2。

（3）GPLP-S1和GPLP-S2的物理狀態(tài)檢測顯示，兩者形態(tài)均為白色粉末，易溶于水，不易溶有機試劑；GPLP-S1和GPLP-S2的化學試驗結果顯示，兩者均不含蛋白質，都具有多糖成分且是非淀粉類多糖，多糖純度分別為91.56%和90.78%。