轉化生長因子β在眼部纖維增生性疾病中的研究新進展

包悅琪，宋 愈

0 引言

纖維化對人體內(nèi)多個臟器產(chǎn)生影響。在病理情況下，正常的組織修復反應逃脫了穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制，并演變成一種不受控制的纖維化過程。這種病理過程的主要特征是大量纖維化組織的進行性蓄積，從而破壞了正常的組織結構并最終導致器官衰竭[1]。全身多個臟器可發(fā)生纖維化，包括肺、腎、肝、心、眼等[2-6]。很多機制均可引起組織的纖維化，這其中包含細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過量積累和肌成纖維細胞的出現(xiàn)[7]。組織損傷后，為了響應細胞內(nèi)微環(huán)境的改變，肌成纖維細胞產(chǎn)生許多纖維化和炎癥介質(zhì)及ECM蛋白[如膠原蛋白(collagen，COL)、層粘連蛋白、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、肌腱蛋白]。這些細胞不僅能直接分泌ECM，還能通過基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)間接重塑ECM。除此之外，ECM自身也能影響細胞粘附、遷移和增殖[8-10]。

1 TGFβ與纖維化

轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)是肽生長因子超家族的原型，參加生長發(fā)育、免疫炎癥反應、組織修復和癌癥等生理和病理過程[11-12]。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)3種TGFβ亞型(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)，其在氨基酸水平上有70%～82%的同源性[13]。TGFβ誘導細胞的促纖維化活性，其存在于各種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程中[10]。

細胞外TGFβ以無活性的同型二聚體形式存在，某些蛋白酶能解開此二聚體，釋放出活化的TGFβ?；罨腡GFβ與細胞膜上的TGFβ受體Ⅱ(TGFβ receptor Ⅱ，TβRⅡ)相結合[13]。TGFβ與TβRⅡ結合后的胞內(nèi)轉導途徑十分復雜，涉及Smad介導的經(jīng)典信號通路和非Smad介導的非經(jīng)典信號通路。在經(jīng)典信號通路中，與配體結合的TβRⅡ募集并磷酸化TGFβ受體Ⅰ(TGFβ receptor Ⅰ，TβRⅠ)。活化的TβRⅠ將Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2/Smad3與Smad4結合形成Smad復合體并進入細胞核誘導基因轉錄[10]。非經(jīng)典TGFβ信號通路是一些不依賴于Smads的途徑，包括p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun terminal kinase，JNK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)、Rho家族三磷酸鳥苷酶[14]。

TGFβ作為ECM積累的主要調(diào)節(jié)因子從而成為纖維化的關鍵驅動因素[15]。TGFβ能上調(diào)FN和COL這兩種主要ECM蛋白的表達和合成，還能上調(diào)層粘連蛋白、骨橋蛋白、肌腱蛋白、彈性蛋白、核心蛋白聚糖等其它ECM蛋白[16-17]。TGFβ在成纖維細胞表型的確定及功能中起關鍵作用，其能夠刺激誘導成纖維細胞活化并引導它們分化為肌成纖維細胞[10]。TGFβ還通過激活Rho A/ROCK通路將間充質(zhì)干細胞分化為肌成纖維細胞[17]。在纖維化疾病中，細胞通過上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程轉分化為肌成纖維細胞，而TGFβ信號通路在EMT過程中起著十分重要的作用[18]。

2 TGFβ與眼部纖維增生性疾病

2.1 TGFβ與角膜瘢痕角膜各層結構損傷可引發(fā)一系列傷口愈合反應，引起角膜瘢痕從而導致視力喪失。角膜瘢痕是一種重要的眼部疾病，已成為第三大全球致盲病因。由于解剖學位置的特殊性，角膜易受到機械和化學損傷。角膜是透明的無血管組織，由3種不同的細胞層組成，即表面的角膜上皮層，中央的角膜基質(zhì)層，最內(nèi)層的角膜內(nèi)皮層[19]。ECM結構中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型COL和蛋白多糖對于維持角膜的透明度是必不可少的[7]。

正常靜息狀態(tài)下，基質(zhì)中的角膜細胞轉分化為肌成纖維細胞，并向損傷部位增殖和遷移以完全修補傷口，過量ECM蛋白(如FN、COL)的沉積和相互交錯致使正常角膜ECM組織結構破壞[7]。已發(fā)現(xiàn)TGFβ在高代謝活性角膜肌成纖維細胞的產(chǎn)生中起關鍵作用[20]。肌成纖維細胞本身能夠分泌TGFβ，可通過自分泌機制維持自身活力[8]。TGFβ使肌成纖維細胞持續(xù)存在，即持續(xù)分泌和堆積異常ECM，從而導致角膜混濁。即使肌成纖維細胞從損傷部位消失，該混濁狀態(tài)仍將持續(xù)很長時間[21]。

針對角膜纖維化，近年來傾向于采用TGFβ信號通路靶向治療。Mohan等[22]培養(yǎng)人角膜基質(zhì)成纖維細胞并用TGFβ處理后發(fā)現(xiàn)，轉染核心蛋白多糖(一種內(nèi)源性TGFβ抑制劑)可抑制TGFβ誘導的促纖維化基因(包括FN和Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型COL)水平上調(diào)。Chowdhury等[23]通過建立大鼠角膜堿燒傷模型發(fā)現(xiàn)，載有吡非尼酮(TGFβ抑制劑)的納米顆粒也能抑制TGFβ誘導的Ⅰ型COL上調(diào)，從而抑制角膜混濁。Sriram等[24]用小干擾陽離子納米顆粒(由TGFβ1、TβRⅡ和結締組織生長因子組成)治療離體角膜堿燒傷兔，結果顯示該小干擾顆粒能夠顯著抑制角膜瘢痕形成。

2.2 TGFβ與青光眼青光眼是一種進行性視神經(jīng)病變，已成為全球第二大不可逆的致盲眼病。其特征在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGC)丟失，從而導致視神經(jīng)乳頭(optic nerve head，ONH)的形態(tài)變化和相應視野缺損，并最終造成永久性視力喪失[25]。該病發(fā)病和進展的主要風險因素是眼壓升高。房水由睫狀體產(chǎn)生并主要通過小梁網(wǎng)(trabecular meshwork，TM)途徑排出，房水生成過多和排出受阻尤其是排出管道結構中的TM組織進行性纖維化均可使眼壓升高[6]。

原發(fā)性開角型青光眼患者的房水和ONH中TGFβ水平均升高[7]。TGFβ明顯改變TM中ECM的變化，使得房水流出阻力增加，眼壓升高[26]。TGFβ還可以誘導TM細胞進行肌成纖維細胞轉分化，同時上調(diào)原代人TM細胞中的間充質(zhì)標記物[27]。ONH的篩板中含有ECM大分子，包括彈性蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型COL[25]。TGFβ可以誘導該區(qū)域發(fā)生纖維化，導致RGC軸突的機械性變形，損害軸漿運輸和神經(jīng)營養(yǎng)的供應[26]。

研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ在過濾性青光眼手術后眼部瘢痕形成中起主要作用。小梁切除術是經(jīng)典的青光眼濾過手術，術后主要并發(fā)癥是由切口部位的結膜纖維化造成經(jīng)鞏膜管腔的瘢痕粘連，從而導致濾過泡引流不暢，眼壓降低不足[28]。臨床上通過局部注射抗腫瘤藥(如絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶)可以起到術后抗結膜瘢痕的作用[29]。此外，有研究表明抗過敏藥也能減少青光眼術后瘢痕。對小梁切除術后患者給予0.5%曲尼司特可以使濾過泡增大，且眼壓降低[30]。Zhong等[31]對新西蘭兔行小梁切除術，術后使用0.5%吡非尼酮滴眼液可以提高濾過泡存活率，提示吡非尼酮滴眼液可能成為青光眼濾過手術后抗纖維瘢痕的新藥。但上述幾種藥物的作用機制是否與TGFβ有關仍有待于進一步研究。

2.3 TGFβ與后發(fā)性白內(nèi)障白內(nèi)障患者晶狀體透明度喪失，是全球致盲的最主要原因?，F(xiàn)有的主要治療方法是外科手術。然而，盡管術后視力得以恢復，仍然有35%的患者在術后發(fā)生后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)，需要行進一步手術[7]。PCO是白內(nèi)障術后后囊膜的纖維化反應，是晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)增殖、遷移和轉分化的結果。LECs通常位于晶狀體前囊內(nèi)側，且在白內(nèi)障術后仍保留在囊袋內(nèi)并逐漸遷移至后囊[32]。

TGFβ1和TGFβ2均可由LECs表達，活化的TGFβ水平在白內(nèi)障術后顯著升高[7]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TGFβ誘導LECs發(fā)生EMT，并轉分化為肌成纖維細胞，其在形態(tài)學和生物學上均與PCO的形成類似[33]。在人囊袋模型中，用TGFβ處理LECs可誘導肌成纖維細胞轉分化并產(chǎn)生異常的ECM[7]。研究表明，敲除Smad2和Smad3能有效抑制TGFβ2介導的細胞增殖、遷移和ECM的產(chǎn)生，表明晶狀體中TGFβ/Smad信號通路介導EMT的發(fā)生[34]。此外，ERK通路也在TGFβ2誘導的EMT中被激活，抑制該通路后，完全阻止了TGFβ2誘導FN和Ⅰ、Ⅳ型COL的表達并抑制肌成纖維細胞的表型[35]。

目前，預防PCO的藥物較多，但其作用機制不盡相同。研究表明，5-氟尿嘧啶可減少兔LECs增殖并誘導細胞凋亡[36]。Chandler等[37]發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)歷EMT反應的犬LECs中環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)的表達增高，使用塞來昔布治療后，COX2表達降低，從而導致LECs的遷移和增殖減少，凋亡增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，吡非尼酮可通過抑制人LECs細胞TGFβ2通路減少細胞增殖和遷移，從而起到抗纖維化的作用。吡非尼酮能夠抑制TGFβ2通路中Smads的表達，并且阻止Smads在LECs的細胞核上積聚及易位[38]。近年來隨著納米科技的發(fā)展，納米材料的使用可以有效預防PCO，氧化鋅納米顆?？梢砸种芁ECs增殖，此外納米材料也可以作為5-氟尿嘧啶、阿霉素、染料木黃酮的藥物載體使用從而抑制LECs的形成[32]。

2.4 TGFβ與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是手術修復孔源性視網(wǎng)膜脫離的嚴重并發(fā)癥，其特征是在視網(wǎng)膜前表面形成纖維膜[39]。視網(wǎng)膜前膜(epiretinal membranes，ERM)收縮導致視網(wǎng)膜結構異常，使視網(wǎng)膜皺縮、折疊并最終導致牽拉性視網(wǎng)膜脫離[40]。PVR的纖維膜由視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和巨噬細胞組成[41]。其中，成纖維細胞和肌成纖維細胞是ERM內(nèi)的主要收縮細胞表型，在PVR的收縮期起關鍵作用[40]。

在PVR的發(fā)病機制中，RPE細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均十分重要。RPE細胞通過EMT為成纖維細胞樣細胞，增殖并產(chǎn)生ECM成分，從而參與纖維化過程[41]。神經(jīng)膠質(zhì)細胞被激活后合成大量的神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白，形成神經(jīng)膠質(zhì)增生的網(wǎng)絡，并調(diào)節(jié)ECM蛋白(層粘連蛋白、FN、肌腱蛋白)的產(chǎn)生[42]。PVR患者的玻璃體和ERM中TGFβ的表達均上調(diào)，且TGFβ2的表達水平與疾病嚴重程度呈正相關[7]。經(jīng)典的TGFβ/Smad信號通路和非經(jīng)典的TGFβ(p38 MAPK、ERK、PI3K/AKT)信號通路均在調(diào)節(jié)RPE細胞的EMT過程中起重要作用[7]。

雖然治療PVR的方法很多，如抗炎、抗增殖、抗腫瘤、抗生長因子、抗氧化等，但均未被納入臨床常規(guī)治療[43]。在動物模型中，5-氟尿嘧啶對PVR有積極的影響，但在臨床試驗中出現(xiàn)嚴重的副作用[39]。近年將抗血管生成藥用于治療PVR，結果發(fā)現(xiàn)雷珠單抗可降低PVR患者玻璃體中血管生成因子的表達[44]。此外，研究表明類固醇可減少血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，同時也對神經(jīng)膠質(zhì)細胞和RPE細胞的增殖產(chǎn)生影響[45]。Khanum等[46]建立兔眼底穿透性損傷模型，在玻璃體腔內(nèi)注射0.5% 吡非尼酮后能防止創(chuàng)傷后PVR的形成。此外，有學者基于遺傳學和生物學標記物設計新的PVR治療策略，但研究結果尚需進一步證實[39]。

2.5 TGFβ與增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變是40歲以上人群視力喪失的主要原因之一。隨著糖尿病的進展，可引起視網(wǎng)膜上小血管缺血缺氧，導致視網(wǎng)膜表面新生血管和纖維膜形成[7]。細胞增殖、ECM伸展和新生血管形成是增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)發(fā)生和進展的關鍵步驟[47]。這些新生血管往往滲透性強、脆性高，故容易損傷，其生長常伴隨著ECM堆積，從而形成延伸到玻璃體內(nèi)的纖維血管膜[48-49]。PDR終末階段，新形成的纖維血管膜收縮，可導致玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離，甚至失明[48]。

PDR患者的視網(wǎng)膜纖維血管膜含有經(jīng)內(nèi)皮細胞轉化而來的肌成纖維細胞，該細胞負責ECM的產(chǎn)生和積聚[49]。肌成纖維細胞可分泌MMP2和MMP9，其能促進內(nèi)皮細胞遷移并釋放與基質(zhì)結合的生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，該因子在新生血管形成中作用突出[7]。TGFβ在PDR過程中起重要作用，PDR患者玻璃體液中TGFβ2水平較無糖尿病患者高[48]。PDR發(fā)生過程中，TGFβ與VEGF的產(chǎn)生密切相關，敲除TGFβ的小鼠表現(xiàn)出PDR表型，分析是由于VEGF等促血管生成因子水平增加而產(chǎn)生高滲性新生血管引起的[50]。

全視網(wǎng)膜激光光凝術是PDR的主要治療方法。該方法用激光燒灼除黃斑部以外的整個視網(wǎng)膜周圍，這種治療方法降低了50%的患者顯著視力喪失的風險[51]。當PDR出現(xiàn)威脅視力的并發(fā)癥時，如玻璃體出血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、黃斑前膜，則需行玻璃體切除術[52]。近年來，玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物已成為治療PDR引起的黃斑水腫的一線治療方案，這類藥物能夠抑制血管生成并誘導新生血管消退，治療黃斑水腫[53]。此外，眼內(nèi)使用皮質(zhì)類固醇激素，如曲安奈德，可調(diào)節(jié)炎癥反應，抑制前列腺素釋放，抑制細胞增殖并穩(wěn)定新生血管，偶爾也可用于治療黃斑水腫[51]。

2.6 TGFβ與濕性年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達國家55歲以上人群失明的主要原因，根據(jù)病理類型分為干性和濕性[54]。濕性年齡相關性黃斑變性(wet age-related macular degeneration，wARMD)的特征是脈絡膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)，這些新生血管突破Bruch膜長入視網(wǎng)膜下腔，發(fā)生滲漏、出血，并最終形成視網(wǎng)膜下纖維化及盤狀瘢痕[55]。視網(wǎng)膜下纖維化伴隨傷口愈合反應，其特征在于各種細胞的增殖和浸潤，包括神經(jīng)膠質(zhì)細胞、RPE細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞，上述細胞與生長因子和炎癥細胞因子相互作用，導致ECM大量重塑[7]。

新生血管的形成可募集更多炎癥細胞和成纖維細胞，這可能是肌成纖維細胞的直接或間接來源。這些細胞產(chǎn)生ECM，并在基底層上增殖和遷移以遮蓋和更新受損組織[56]。wARMD患者房水中TGFβ1的含量較白內(nèi)障患者高，說明TGFβ在wARMD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[57]。在ARPE-19細胞中，TGFβ2促進細胞進入膠原并誘導Ⅰ型COL和FN的表達，而這兩種蛋白對視網(wǎng)膜下纖維化中的細胞遷移起重要作用[58]。此外，TGFβ可誘發(fā)人胎兒RPE細胞中的EMT過程，并可作用于肌纖維母細胞以促進其纖維化[59]。

目前臨床上以抗VEGF藥物的使用作為wARMD的一線治療方案。在動物CNV模型中，腺病毒相關載體8可有效地轉導到視網(wǎng)膜下，并且持續(xù)控制血管生成，這一過程通過介導可溶性fms樣酪氨酸激酶1來實現(xiàn)[60]。E10030(ophthotech)是一種抗血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)的聚乙二醇化適體。在一項臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗中，相比單用雷珠單抗，與E10030聯(lián)合使用可提高wARMD患者62%的視力，且無副作用[61]。另有研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇可調(diào)節(jié)wARMD相關的新生血管形成，對細胞遷移、增殖產(chǎn)生影響，參與激活在CNV發(fā)生過程中起重要作用的因子，如VEGF、PDGF、成纖維細胞生長因子等[62]。

3 小結

在穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，纖維化呈自限性，是一個重要的自我修復過程，該過程通過正常的組織修復反應恢復受損組織的功能完整性。然而，當機體穩(wěn)態(tài)失調(diào)，出現(xiàn)病理性組織修復反應時則產(chǎn)生危害。纖維化的病理過程主要涉及肌成纖維細胞和ECM，而TGFβ及其下游信號通路在纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。近年，纖維化在眼科疾病中的作用越來越被關注，隨著生物工程技術的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，對于眼部纖維增生性疾病的治療一定會展現(xiàn)出新的希望，從而給患者的預后帶來福音。