高效液相色譜法測(cè)定保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量

趙昱瑋 盛雪 唐超 劉健 劉秀華 曹揚(yáng) 高其品

[摘要]目的 采用高效液相色譜法測(cè)定保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量，為進(jìn)一步提高其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus Cl8（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。結(jié)果 葛根素在8.48106～42.4053μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r>0.9990）;平均加樣回收率（n=6）分別為101.47%。結(jié)論 建立了五味子猴菇口服液中葛根素的含量測(cè)定的方法，方法重復(fù)性良好，為該保健食品的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法;五味子猴菇口服液;葛根素;含量測(cè)定

[中圖分類(lèi)號(hào)]R917

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2020）01-39-04

五味子猴菇口服液以吉林省道地中藥材五味子、東北特產(chǎn)猴頭菇為主要原料，以及對(duì)肝損傷有保護(hù)作用的銀耳、葛根、甘草、枳棋子等原料開(kāi)發(fā)的一種對(duì)酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)作用的保健食品。五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲等均有降低因化學(xué)物質(zhì)引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、誘導(dǎo)肝臟藥物代謝酶的作用。五味子對(duì)BCG+LPS誘發(fā)的肝損傷有顯著的防治作用，從免疫機(jī)制的角度證明了五味子的保肝降酶作用[1-4]。猴頭菇其藥效成分主要有多糖、低聚糖、猴頭菇素和猴頭菇酮等，具有保肝養(yǎng)胃、增強(qiáng)免疫力、降血糖、保護(hù)神經(jīng)、抗癌和抗氧化等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇中多糖成分在胃黏膜保護(hù)方面作用尤為突出[5-7];銀耳多糖口服或腹腔注射能對(duì)抗谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，緩解肝細(xì)胞損傷[8-9];葛根提取物（主要成分為葛根總黃酮和葛根素）能提高小鼠對(duì)酒精的耐受閾值和醉酒潛伏期，加速酒精代謝、降低其肝毒性[10-11];甘草浸膏口服，對(duì)四氯化碳所致大鼠肝損傷有明顯保護(hù)作用[12-13];枳棋子有顯著的解酒、保肝、抗肝纖維化等作用，水提取液可顯著縮短小鼠酒醒時(shí)間、加快乙醇代謝，對(duì)乙醇所致肝損傷的預(yù)防作用等[14-16]。我國(guó)保健食品市場(chǎng)對(duì)于酒精肝損傷的護(hù)肝保肝產(chǎn)品需求量很大，盡管市場(chǎng)該類(lèi)產(chǎn)品的研發(fā)很多，但大多數(shù)產(chǎn)品的功效不顯著。本研究采用HPLC對(duì)保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量控制提供有利依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

高效液相色譜儀（1260型，美國(guó)安捷倫）;超聲波清洗器（KQ-500型，昆山市超聲儀器有限公司）;電子天平（BSA224S-CW型，賽多利斯電子天平），電子天平（QUINTIX125D-1CN型，賽多利斯電子天平）。

純凈水（娃哈哈），乙腈（色譜純），其他試劑均為分析純。葛根素對(duì)照品（含量均大于95.4%，110752-201615，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。五味子猴菇口服液（規(guī)格為：25mL/瓶;批號(hào)分別為：20181201， 20181202， 20181203，自制）。

1.2方法

1.2.1色譜條件 1260型Agilent高效液相色譜儀，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）;進(jìn)樣量：10μL;柱溫：25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm;流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（12：88）;流速：1.0mL/min。

1.2.2溶液的制備[17]

1.2.2.1供試品溶液的制備 吸取五味子猴菇口服液5mL，置25mL容量瓶中，精密稱(chēng)定，加70%甲醇至刻度，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）5min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.2對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品8.89mg（純度為95.4%），于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取l.OmL于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為16.96212μg/mL的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果

2.1線性關(guān)系

精密吸取“1.2.2.2”對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分別至25mL容量瓶中，加甲醇的定容至刻度，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得線性方程為Y=45.167X+4.2168，r=0.9999，結(jié)果表明葛根素濃度在8.48106～42.4053μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。見(jiàn)表1、圖1。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為20181201的五味子猴菇口服液，照“1.2.2.1”制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48h按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果葛根素含量的RSD分別為0.4%。

2.3精密度試驗(yàn)

取同一供試品（20181201），按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果葛根素含量的RSD分別為0.3%。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為20181201的五味子猴菇口服液，照“1.2.2.1”方法制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果葛根素含量的RSD分別為1.4%。

2.5加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批五味子猴菇口服液（20181201）6份各5mL，精密稱(chēng)定，分別加入葛根素對(duì)照品1mL（濃度為0.424053mg/mL）按“1.2.2.1”制備供試品溶液，按“1.2.1”條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行加樣回收率考察，平均回收率為101.47%，RSD為1.10%（n=6），表明本方法測(cè)定葛根素準(zhǔn)確率較高，回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6樣品含量測(cè)定

按“1.2.2.1”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算葛根素的含量，見(jiàn)表3。

3 討論

3.1流動(dòng)相和樣品前處理的考察

本試驗(yàn)參照“GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的測(cè)定”，對(duì)流動(dòng)性洗脫系統(tǒng)、樣品前處理進(jìn)行了考察[10]。

3.1.1流動(dòng)相選擇 考察了乙腈一磷酸溶液及甲醇一磷酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相的洗脫系統(tǒng)，色譜峰形好，分離度較好，因此選擇乙腈-0.05%磷酸溶作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.1.2試樣處理 對(duì)“GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的測(cè)定”中試樣處理的兩種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果試樣加適量70%甲醇，超聲提取，定容后分析的方法優(yōu)于試樣上D101大孔吸附樹(shù)脂層析柱，再用70%甲醇洗脫，蒸干定容的方法，原因在于五味子猴菇口服液為口服液，上D101大孔吸附樹(shù)脂層析柱進(jìn)行柱層析方法繁瑣，回收率較低、重復(fù)性較差，故選擇前者為試樣處理方法。

3.2色譜柱考察

對(duì)不同廠家色譜柱進(jìn)行了考察，選用了Diamonsil（鉆石）C18（4.6mm×250mm，5μm）、Shimadzu C18（4.6mm×250mm，5μm）、AgilentZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）三種不同色譜柱，結(jié)果Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）對(duì)葛根素的分離效果最好。

西醫(yī)目前主要從戒酒、營(yíng)養(yǎng)支持和藥物治療兩個(gè)方面治療酒精性肝損傷，但作用較局限;以中藥原料在對(duì)化學(xué)性肝損傷又輔助保護(hù)功能的保健食品中應(yīng)用較為普遍，劑型的選擇以服用方便、便于攜帶為主[18-20]。五味子猴菇口服液以五味子、猴頭菇、銀耳、葛根、甘草、枳棋子等原料，經(jīng)過(guò)制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)合藥理活性篩選的最佳處方，以保證其安全、有效、合理，為開(kāi)發(fā)保健食品提供理論依據(jù)。

本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定五味子猴菇口服液中葛根素的含量方法，通過(guò)方法學(xué)的考察確定以250nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，70%甲醇為提取液，超聲提取5min，葛根素在8.48106～42.4053μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r>0.9990），平均加樣回收率（n=6）分別為101.47%，結(jié)果準(zhǔn)確，方法可操作性強(qiáng)。

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（收稿日期：2019-05-31）

[基金項(xiàng)目]吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2019155）;吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20180623037TC）。