miR-601靶向調(diào)控MMP-17抑制非小細胞肺癌的遷移和侵襲

駱曼，李靈毅

0 引言

非小細胞肺癌（NSCLC）是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都位居惡性腫瘤的第1位[1]。雖然早期手術(shù)及靶向藥物的治療措施不斷完善，但我國每年仍然有超過400萬人死于肺癌及相關(guān)疾病，腫瘤細胞早期侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡率高的主要原因[2-3]。因此探尋非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制，尋找可能干預(yù)的靶位點具有重要的臨床意義[4]。已有研究表明，miR-601能夠調(diào)控多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]，然而在非小細胞肺癌中的功能并不清楚。本研究將深入探討miR-601在調(diào)控肺癌細胞遷移侵襲中的作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年3月—2017年9月在武漢市第一醫(yī)院胸心外科治療的25例非小細胞肺癌患者（術(shù)后病理確診），其中男17例、女8例，平均年齡（57.34±7.84）歲，所有患者均為第一次診斷及治療，無放化療病史。手術(shù)切取瘤體區(qū)域及正常肺組織（距離瘤體邊界大于5 cm），并迅速置于液氮罐中臨時存儲，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。術(shù)中患者肺癌侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況按照人民衛(wèi)生出版社出版的內(nèi)科學(xué)第8版[6]分期標準進行。本研究中所有患者均簽署知情同意書，并得到醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 細胞系

人非小細胞肺癌細胞A549、H1299及人腎上皮細胞293T均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。三種細胞均采用含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，并在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測

TRIzol法提取組織及細胞的總RNA，并采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：16℃30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。引物如下：miR-601特異性引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTCCTCC-3’，U6特異性引物5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。采用SYBR Green實時熒光定量PCR法進行擴增，反應(yīng)條件為：95℃熱啟動10 min；隨后95℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；至4℃結(jié)束。定量擴增引物如下：miR-601上游引物5’-TCGGCAGGTGGTCTAGGATTGTT-3’，下游引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；MMP-17上游引物5’-GACCTGTTTGCAGTGGCTGT-3’，下游引物5’-ACGATCTTGTGGTCGCTGGT-3’；GAPDH上游引物5’-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游引物5’-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染實驗

將A549細胞或H1299細胞接種于6孔板（2.0×105個/孔），當細胞生長達到60%左右時，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-NC對照組、miR-601 mimics實驗組（均購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司）轉(zhuǎn)染到細胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 Transwell遷移及侵襲實驗

采用無Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室分別進行細胞遷移和侵襲實驗。將處于對數(shù)生長期的細胞制成1×106個/毫升濃度的細胞懸液，然后在上室中加入100 μl的細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，每室設(shè)3個對照。細胞培養(yǎng)24 h后取下Transwell小室，用棉簽蘸去小室上面的細胞，隨后4%多聚甲醛固定及0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下進行侵襲細胞計數(shù)。

1.6 Western blot檢測

用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，在4℃以12 000g離心15 min后取上清液，并測定蛋白濃度。將加入上樣緩沖液的上清液在100℃變性5 min，取50 μg加入到SDSPAGE凝膠泳道中進行電泳，并將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，加入濃度1:1 000一抗于4℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入濃度1:2 000二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入ECL進行顯影分析。本研究所用MMP-17兔抗人多抗和GAPDH兔抗人多抗均購自美國Abcam公司，二抗購自上海碧云天公司。

1.7 熒光素酶活性檢測

將處于對數(shù)生長期的293T細胞接種到48孔板中（4.0×104個/孔），培養(yǎng)24 h后，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒說明書將miR-601 mimics（20 nmol）、3’UTR報告載體（80 ng）和pRLTK（表達海腎熒光素酶蛋白作為實驗的內(nèi)參，40 ng）分別轉(zhuǎn)到293T細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay裂解細胞并用多功能酶標儀測定熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究相關(guān)統(tǒng)計分析由SPSS 20.0軟件完成，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，兩組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-601在NSCLC組織中的表達及與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

RT-qPCR檢測結(jié)果表明與癌旁正常組織相比，miR-601在NSCLC組織中的表達水平明顯下調(diào)（P＜0.001），見圖1A，且miR-601表達水平與腫瘤組織的浸潤（P＜0.007）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.011）密切相關(guān)，見圖1B～C。

2.2 miR-601對NSCLC細胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-601 mimics的A549細胞或H1299細胞遷移及侵襲數(shù)目均明顯減少，見圖2A～B。

2.3 MMP-17為miR-601直接調(diào)控的靶基因

miRWalk 3.0軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MMP-17 mRNA 3’UTR 存在miR-601的結(jié)合位點。成功構(gòu)建MMP-17野生型及突變型3’UTR報告載體，見圖3A。結(jié)果表明，miR-601 mimics可抑制野生型3’UTR報告載體熒光素酶活性，而對突變型3’UTR報告載體熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用，見圖3B。進一步研究發(fā)現(xiàn)，瞬時轉(zhuǎn)染miR-601 mimics可明顯抑制A549細胞或H1299細胞中MMP-17的mRNA和蛋白表達，見圖3C。

2.4 miR-601通過調(diào)控MMP-17抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲

為進一步評估MMP-17是否為miR-601功能性靶基因，通過瞬時轉(zhuǎn)染MMP-17后發(fā)現(xiàn)A549細胞或H1299細胞的遷移及侵襲能力增強，但當引入miR-601 mimics后細胞遷移和侵襲能力明顯被逆轉(zhuǎn)，見圖4。這些結(jié)果說明，miR-601可有效抑制MMP-17對NSCLC細胞的遷移和侵襲。

3 討論

miRNA在非小細胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。一方面miRNA可以作為抑癌因子抑制原癌基因的激活，從而抑制腫瘤的生長；另一方面miRNA通過下調(diào)腫瘤抑制因子或抑癌基因表達從而產(chǎn)生致癌作用[7]。此外，具有特征性的miRNA表達指紋譜在非小細胞肺癌的早期診斷、靶向療效和預(yù)后評估等方面也具有重要價值[8]。因此，研究miRNA與非小細胞肺癌發(fā)病機制之間的關(guān)系，對肺癌的臨床診斷、治療及預(yù)防具有積極的意義。

圖2 Transwell檢測miR-601對A549細胞及H1299細胞遷移(A)和侵襲(B)的影響Figure 2 Effect of miR-601 on migration(A) and invasion (B) of A549 and H1299 cells detected by Transwell assay

圖3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-601與MMP-17基因3'UTR區(qū)的結(jié)合Figure 3 Binding of miR-601 to 3'UTR region of MMP-17 gene detected by dual luciferase reporter assay

圖4 miR-601通過調(diào)控MMP-17表達(A)抑制A549細胞及H1299細胞的遷移(B)和侵襲(C)Figure 4 miR-601 inhibited migration(B) and invasion(C) of A549 and H1299 cells by regulating MMP-17 expression (A)

既往研究表明，miR-601在調(diào)控腫瘤細胞惡性表型方面具有重要作用，包括結(jié)直腸癌[9]，食管鱗狀細胞癌[10]，乳腺癌及胰腺癌[11-12]。Wang等發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血漿中miR-601水平顯著降低，且降低的程度與患者疾病的進展有著密切關(guān)系，對晚期結(jié)直腸癌的診斷具有重要的價值[9]。Yang等發(fā)現(xiàn)miR-601在食管鱗狀細胞癌中上調(diào)，并增加了食管鱗狀細胞癌變的風(fēng)險[10]。Hu等發(fā)現(xiàn)miR-601可以通過直接靶向PTP4A1來抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。Cao等發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中miR-601可以抑制發(fā)育調(diào)節(jié)因子SIRT1的表達，從而抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移[12]。此外，F(xiàn)leming等發(fā)現(xiàn)miR-601作為抑癌因子，通過調(diào)節(jié)SIRT1和BCL2L2抑制前列腺癌細胞的增殖[13]。本研究通過對比非小細胞肺癌組織及癌旁組織中miR-601的表達量，發(fā)現(xiàn)miR-601在肺癌組織中表達明顯降低，且降低程度與癌細胞的浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這表明miR-601在非小細胞肺癌的發(fā)展中具有一定的作用。為了研究miR-601是對肺癌細胞功能的影響，我們以A549細胞及H1299細胞為模型觀察miR-601對肺癌細胞遷移及侵襲的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-601能明顯抑制細胞的遷移及侵襲能力。

隨后，我們通過靶基因預(yù)測及雙熒光素酶實驗驗證了MMP-17是miR-601直接調(diào)控的靶基因。MMP-17作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，通過降解細胞外基質(zhì)從而促進腫瘤細胞突破基底膜和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織學(xué)屏障，從而侵襲周圍組織和轉(zhuǎn)移至遠處組織[14]。研究表明，MMP-17參與多種腫瘤的運動、侵襲及轉(zhuǎn)移，包括乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌及頭頸部腫瘤等[14]。Atkinson等也發(fā)現(xiàn)MMP-17也被證明在非小細胞肺癌中組織中高表達，并可能和肺癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。在本研究中，過表達MMP-17確實會增強A549細胞及H1299細胞的遷移和侵襲能力，而當轉(zhuǎn)染miR-601時其增強細胞遷移和侵襲的能力明顯被抑制。這些結(jié)果表明miR-601通過抑制MMP-17的表達從而調(diào)控非小細胞肺癌的遷移和侵襲，并可將miR-601/MMP-17調(diào)控軸作為非小細胞肺癌臨床干預(yù)的一個重要靶點。