腫瘤免疫治療PD-1/PD-L1靶向核素分子探針的研究進展

王淑靜，徐曉霞，周欣，劉特立，李囡，朱華，楊志

0 引言

近年來，在腫瘤治療方面，免疫治療表現(xiàn)出令人矚目的療效。程序性細胞死亡蛋白-1（programmed death protein 1,PD-1）及其配體PD-L1是目前臨床應(yīng)用最廣泛的免疫抑制劑。多項臨床試驗發(fā)現(xiàn)，抗PD-1或抗PD-L1單克隆抗體可以通過與PD-1或PD-L1結(jié)合，阻斷PD-1與PD-L1之間的結(jié)合增強機體抗腫瘤的免疫能力，在多種難治性、復發(fā)性腫瘤患者中取得了超預(yù)期的療效[1]。因此，美國食品與藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）通過快速審批通道迅速批準了抗PD-1單抗Pembrolizumab（2014年）、Nivolumab（2014年）及抗PD-L1單抗Atezolizumab（2016年）、Durvalumab（2017年）、Avelumab（2017年）等，均已成為多種腫瘤的標準治療。但臨床試驗結(jié)果表明只有部分腫瘤患者可以受益于這種治療，如一項Nivolumab單藥治療非小細胞肺癌的臨床試驗中，僅20%的患者獲得客觀緩解[2]，而且治療費昂貴，對患者造成沉重的經(jīng)濟負擔[3]。所以，探索一種可以準確預(yù)測患者免疫治療療效的方法十分重要。

目前最常用的預(yù)測患者免疫治療療效的方法是通過免疫組織化學（immunohistochemistry,IHC）檢測腫瘤的PD-L1表達水平及腫瘤浸潤T細胞的PD-1表達水平，已有臨床試驗結(jié)果表明IHC檢測結(jié)果與患者的治療反應(yīng)相關(guān)[4-5]。但有研究發(fā)現(xiàn)該方法并不能十分精準地預(yù)測患者療效，PD-L1陰性患者中仍有15%可以獲益[6]，而且它屬于有創(chuàng)性檢查，難以實現(xiàn)在治療過程中對PD-1/PD-L1表達水平進行動態(tài)監(jiān)測。

核醫(yī)學分子影像使用放射性核素標記探針進行SPECT/PET顯像，可以在治療過程中重復、定量檢測腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的PD-1/PD-L1表達水平的變化，有望成為一種更精準的篩選免疫治療受益患者的檢查方法。本文將對目前關(guān)于PD-1/PD-L1靶向核素探針顯像的臨床前及臨床研究進行總結(jié)，主要包括核素標記完整抗體顯像、核素標記單域抗體顯像及核素標記低分子量探針顯像。

1 PD-1/L1免疫治療篩選獲益患者的困境

一項首個國產(chǎn)抗PD-1單克隆抗體特瑞普利單抗（JS001）治療黑色素瘤、尿路上皮癌、腎細胞癌的Ⅰ期臨床試驗中，PD-L1陽性患者中的客觀緩解率明顯高于PD-L1陰性患者（43.8%vs.0）[7]。但仍有大多數(shù)的PD-L1陽性患者對治療并沒有響應(yīng)，這可能與腫瘤病灶內(nèi)PD-L1表達的異質(zhì)性有關(guān)，依靠穿刺活檢進行的IHC無法避免這一因素的影響。此外，腫瘤細胞PD-L1表達在病程中因各種治療發(fā)生變化，也是導致預(yù)測結(jié)果不準確的原因之一，為減少此因素的影響而進行的重復穿刺活檢將給患者帶來更多的有創(chuàng)性檢查的風險。有研究用PD-L1抗體22C3、28-8、SP263、SP142對38例非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者進行IHC檢測，50%的患者在四種抗體的檢測結(jié)果中被判定為陽性，13%的患者判定為陰性，37%的患者則在四種抗體的cut-off值上下變化[8]。因此，目前IHC檢測的抗體以及評判陽性的標準不統(tǒng)一，也會導致PD-L1表達的IHC檢測結(jié)果不準確[9]，進而造成其預(yù)測患者治療反應(yīng)的不準確。

腫瘤突變負荷（Tumor mutational burden,TMD）是目前多個研究使用的另一個預(yù)測療效的標志物。徐瑞華教授團隊進行的一項特瑞普利單抗單藥用于標準治療失敗的晚期胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，TMD高患者的客觀緩解率（33.3%vs.7.1%,P=0.017）及總生存期（14.6月vs.4.0月，P=0.038）均明顯高于TMD低患者[10]。但TMD面臨著與IHC一樣不能精準預(yù)測的問題，尚需更多的研究探索。同時TMB檢測方法復雜，價格昂貴。

MMR（mismatch repair）基因是指基因組中負責修復DNA錯配的基因。如果MMR基因有缺陷則稱為dMMR（deficient mismatch repair），反之，則稱為pMMR（proficient mismatch repair）。如果存在dMMR，微衛(wèi)星復制過程中會產(chǎn)生高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）。具有dMMR或MSI-H的患者將更能從免疫治療中獲益。Pembrolizumab單藥治療的Ⅱ期臨床試驗中，dMMR結(jié)直腸癌組的客觀緩解率（40%vs.0）及免疫相關(guān)無進展生存率（78%vs.11%）均明顯高于pMMR結(jié)直腸癌組[11]。

目前雖然有一些研究報道其他標志物用來預(yù)測療效，如HLA基因多樣性、DNA甲基化等[12-13]，但仍需進一步研究。

2 PD-1/L1靶向核素探針免疫顯像

PD-1/L1靶向核素探針免疫顯像可以減少穿刺等有創(chuàng)性的檢查，避免腫瘤異質(zhì)性的影響，提供原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶以及全身PD-1/PD-L1表達情況，為PD-1/L1免疫治療的患者提供一種更加準確的篩選方法。同時，核醫(yī)學分子影像可以在治療過程中多次監(jiān)測，有望在治療過程中實時監(jiān)測PD-1/PD-L1的表達變化，為及時調(diào)整免疫治療方案提供更多影像學依據(jù)。

2.1 PD-1/PD-L1靶向核素探針顯像原理

核醫(yī)學分子影像以體內(nèi)特定的分子作為核素探針成像的靶點，能無創(chuàng)地通過影像反應(yīng)靶點分子在人體內(nèi)的表達情況[14]。PD-1/PD-L1靶向核素探針顯像使用放射性單光子或正電子核素標記抗PD-1/PD-L1單抗或小分子，經(jīng)靜脈注射，與體內(nèi)PD-1/L1受體靶向結(jié)合，然后進行核醫(yī)學SPECT或PET顯像，對患者體內(nèi)組織的放射性攝取進行測量，從而實現(xiàn)PD-1/L1受體表達情況的定量檢測。

根據(jù)靶向分子的特征，放射性核素可直接或者通過螯合劑對其進行標記，常用的放射性核素主要包括放射性鹵素及放射性金屬元素。最常用的放射性鹵素是124I，主要通過直接親電取代酪氨酸殘基的方式對靶向分子進行標記。但若靶向分子發(fā)生細胞內(nèi)分解出現(xiàn)脫鹵，124I將從靶向組織中清除導致信號降低，并會導致甲狀腺組織中124I聚集。放射性金屬元素如68Ga、64Cu、89Zr等需要通過雙功能螯合劑如DOTA、NOTA、DFO等對抗體分子進行標記。雙功能螯合劑先與抗體分子的非活性部位共價連接，然后與放射性金屬元素形成穩(wěn)定復合物，是目前PD-1/PD-L1靶向核素探針最常用的標記方法。

2.2 核素標記單克隆抗體顯像

目前已有大量臨床前研究采用核素標記單抗進行顯像，以評估鼠荷人類腫瘤的PD-L1表達水平，見表1。由于單抗較長的生物半衰期，主要使用111In（67.3 h）、64Cu（12.7 h）、89Zr（78.4 h）等（中）長半衰期核素進行標記。

2.2.1 核素標記抗PD-L1單克隆抗體顯像 2015年Heskamp等第一次使用111In標記特異性抗人PD-L1的鼠源性單克隆IgG1抗體PD-L1.3.1進行活體SPECT/CT成像，為PD-L1靶向的核素探針顯像研究奠定了基礎(chǔ)[15]。隨后，Chatterjee團隊發(fā)現(xiàn)，111In-Atezolizumab SPECT/CT顯像和64Cu-Atezolizumab PET/CT顯像可以檢測出荷人腫瘤小鼠模型中PD-L1的表達[16-17]。另一項研究發(fā)現(xiàn)PD-L1靶向探針同樣可以檢測PDX模型中PD-L1的表達[18]。

上述幾項研究均使用免疫缺陷小鼠，未觀察到淋巴系統(tǒng)對探針的攝取。2016年Josefsson等[19]使用111In標記PD-L1抗體進行免疫功能正常小鼠SPECT成像，觀察到脾、胸腺高攝取。Hettich等[20]使用64Cu-NOTA標記PD-1/L1抗體進行免疫功能正常小鼠PET/CT顯像，在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)PD-1及PD-L1，同時該研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)γ干擾素治療，肺是PD-L1表達上調(diào)最明顯的器官，所以抗肺的T細胞反應(yīng)被PD免疫抑制點強烈抑制，提示肺癌患者的PD-L1治療是激活無效的細胞毒性淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）的一個重要手段，同時，這也可能是PD-L1免疫治療經(jīng)常出現(xiàn)肺炎、流感樣疾病、結(jié)節(jié)病等不良反應(yīng)的原因。不良反應(yīng)重癥肌無力則可能與胸腺攝取PD-L1抗體有關(guān)[21]。

表1 核素標記抗PD-L1完整單克隆抗體顯像Table 1 Imaging of radionuclide-labeled complete anti-PD-L1 monoclonal antibody

多項研究顯示PD-L1靶向探針可檢測到治療引起的PD-L1表達的變化[18,20-22]，如放療、紫杉醇治療上調(diào)PD-L1表達，阿霉素治療下調(diào)PD-L1表達。2019年Ehlerding等進行荷瘤小鼠89Zr-Atezolizumab PET顯像發(fā)現(xiàn)，PD-L1+的H460腫瘤經(jīng)放療24 h后PD-L1表達上調(diào)，放射性攝取增高，PD-L1+的脾、淋巴結(jié)的PD-L1表達同樣上調(diào)，與IHC結(jié)果一致[23]。

2.2.2 核素標記抗PD-1單克隆抗體顯像 2015年Natarajan等進行PD-1抗體探針活體PET顯像，發(fā)現(xiàn)腫瘤及淋巴器官高攝取[24]，說明PD-1靶向探針有潛力用于PD-1表達水平的檢測[25]。隨后，多項核素標記完整抗PD-1單抗的顯像研究被報道，見表2。

核素標記完整單抗的優(yōu)勢是與PD-1/PD-L1結(jié)合的親和性強，制備簡單。劣勢是生物半衰期較長，需要使用長半衰期核素標記，顯像所需時間長且腫瘤穿透性差。

2.3 核素標記單域抗體顯像

KN035是目前全球首個進入臨床開發(fā)的PD-L1單域抗體，已經(jīng)被批準進行治療晚期或轉(zhuǎn)移性實體腫瘤的臨床試驗。KN035與完整單抗相比具有較低的分子量，因此具有相對較高的腫瘤穿透性，并可在注射后更短時間內(nèi)進行顯像，同時保持良好的PD-L1親和性。2018年Li等用89Zr-Df-KN035對荷人膠質(zhì)瘤小鼠進行PET顯像發(fā)現(xiàn)腫瘤高攝取，與IHC檢測結(jié)果一致[31]。89Zr-Df-KN035在食蟹猴中顯像顯示，在肝、脾、腎的攝取較高，在唾液腺、淋巴組織出現(xiàn)較早且相對穩(wěn)定，肌肉、腦攝取低。該研究發(fā)現(xiàn)89Zr-Df-KN035具有標記快速、穩(wěn)定的高親和性及腫瘤快速高攝取并可長時間滯留等多種優(yōu)勢，但同時也具有很大的局限性即沒有良好的腫瘤血池比，注射后120 h仍僅為（1.10±0.12）。

2.4 核素標記低分子量探針顯像

低分子量探針優(yōu)點是腫瘤穿透性更強，可被腫瘤快速攝取，從血液、背景組織中快速清除，實現(xiàn)注射當天顯像；缺點是制備較復雜，穩(wěn)定性較差。主要包括抗體片段、納米抗體（Nanobodies,Nbs）、Adectin、多肽等，見表3。

2.4.1 抗體片段 2015年Maute等合成了PD-1的一個可溶性膜外區(qū)片段HAC-PD-1，可以與PD-L1高親和性結(jié)合[32]。在種植有PD-L1陰性及陽性腫瘤的小鼠體內(nèi)注射熒光標記的PD-L1抗體與HACPD-1后發(fā)現(xiàn)，在PD-L1陰性的腫瘤中PD-L1抗體及HAC-PD-1均未出現(xiàn)。而在PD-L1陽性的腫瘤中，PD-L1抗體主要分布在腫瘤邊緣及血管周圍，HAC-PD-1則在腫瘤內(nèi)廣泛分布。64Cu-HAC-PD-1 PET顯像發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性腫瘤高攝取，PD-L1陰性腫瘤無攝取。

表2 核素標記抗PD-1完整單克隆抗體顯像Table 2 Imaging of radionuclide-labeled complete anti-PD-1 monoclonal antibody

2.4.2 納米抗體 2017年Broos等使用99mTc標記Nbs C3、E2進行TC-1腫瘤小鼠SPECT/CT顯像發(fā)現(xiàn)，可以檢測PD-L1不同表達水平，圖像的信號強度與PD-L1的表達水平相關(guān)，且C3可以發(fā)現(xiàn)很小的差異[33]。Nbs在腎臟及膀胱中聚集，在其他器官與已報道的PD-L1抗體相似。但該Nbs不與人PD-L1結(jié)合，需要尋找可以與人PD-L1結(jié)合的Nbs進行臨床轉(zhuǎn)化。

2.4.3 Adnectin Adnectin是一個基于人纖連蛋白Ⅲ型第10個結(jié)構(gòu)域合成的靶向蛋白家族。BMS-986192是一種可與人PD-L1受體高親和性結(jié)合的Adnectin。2017年Donnelly等[34]使用18FBMS-986192對荷瘤小鼠進行PET顯像，顯示PD-L1陽性的HT-29腫瘤攝取顯著高于陰性的L2987腫瘤，且具有很高的腫瘤肌肉比。

2.4.4 多肽成像 WL12是由12個氨基酸構(gòu)成的環(huán)形肽，可以與PD-L1高親和性結(jié)合。2017年Chatterjee等用64Cu-WL12對荷瘤小鼠進行PET成像，顯示hPD-L1腫瘤攝取顯著高于CHO腫瘤[17]。2018年De Silva等對多種腫瘤模型小鼠進行68Ga-WL12 PET/CT顯像，結(jié)果均提示PD-L1高表達的腫瘤攝取高于低表達的腫瘤[35]。

2.5 臨床轉(zhuǎn)化研究

目前，已有三種PD-1/PD-L1靶向探針成功應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化研究。2018年Bensch等[36]用89Zr-Atezolizumab對即將接受Atezolizumab治療的22例晚期膀胱癌、NSCLC、三陰性乳腺癌患者進行PET/CT顯像。腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶均對探針高攝取，但不均質(zhì)，在不同患者、同一患者的不同病灶及不同類型的腫瘤之間均有差異。89Zr-Atezolizumab的幾何平均SUVmax可用來有效分區(qū)客觀緩解患者與病情穩(wěn)定或病情進展患者（AUC 0.83），完全緩解患者SUVmax比發(fā)生進展的患者高235%（P=0.00021）?；颊叩膸缀纹骄鵖UVmax與PFS、OS高度相關(guān)，在中位數(shù)以下的患者更易發(fā)生進展或死亡。89Zr-Atezolizumab的SUVmax同樣與病灶在治療前后的變化相關(guān)，SUVmax越大，病灶縮小越多。而該研究使用SP142、SP163兩種IHC抗體檢測腫瘤病灶的PD-L1表達水平，結(jié)果與腫瘤病灶的治療反應(yīng)、腫瘤大小的變化、PFS及OS均無相關(guān)性。該研究結(jié)果表明89Zr-Atezolizumab PET/CT有潛力成為預(yù)測Atezolizumab治療反應(yīng)的一種更有效的檢查方法。

2018年Niemeijer等[37]用18F-BMS-986192、89Zr-Nivolumab對13例即將接受Nivolumab治療的晚期NCSLC患者進行PET/CT雙探針對比顯像，并使用IHC方法檢測腫瘤的PD-L1、PD-1表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1≥50%的腫瘤對18F-BMS-986192攝取明顯高于PD-L1＜50%的腫瘤（Median SUVpeak:8.2vs.2.9,P=0.018），PD-1陽性的腫瘤對89Zr-Nivolumab攝取同樣明顯高于PD-1陰性的腫瘤（Median SUVpeak:7.0vs.2.7,P=0.03）。5例獲得客觀緩解的患者腫瘤攝取18F-BMS-986192（Median SUVpeak:6.5vs.3.2,P=0.03）及攝取89Zr-nivolumab（Median SUVpeak:6.4vs.3.9,P=0.019）明顯高于8例未獲得客觀緩解的患者。表明PET分子顯像將有潛力成為評估患者PD-1/L1狀態(tài)及預(yù)測免疫治療反應(yīng)的重要手段。但此結(jié)論尚需要更大的樣本量進行驗證。

3 結(jié)語

腫瘤免疫治療通過靶向單抗與體內(nèi)受體特異性結(jié)合激活自身免疫系統(tǒng)的腫瘤殺傷能力，已成為腫瘤傳統(tǒng)治療外的一個重要的治療方法。其中PD-1/PD-L1免疫治療表現(xiàn)尤為出色，已改變多種晚期腫瘤的治療格局，但其有效率較低且治療費用昂貴，無法普遍應(yīng)用，而目前篩選獲益患者的方法如IHC、TMD、dMMR等均不能對PD-1/PD-L1療效進行精確預(yù)測，這仍是一個亟需解決的重要問題。PD-1/PD-L1靶向核素分子探針核醫(yī)學顯像，能無創(chuàng)地反應(yīng)PD-1/PD-L1在人體內(nèi)的表達情況，是解決這一問題的重要探索方向。其中，核素標記完整單抗分子探針具有良好的親和性，制備簡單，可以觀察單抗在機體內(nèi)的完整代謝過程，但由于分子量較大（約145 kDa）導致腫瘤穿透性差、生物半衰期較長、顯像所需時間長（通常需要2～7天），這導致在臨床應(yīng)用中比較困難。單域抗體探針分子量相對完整單抗較小，具有較高的腫瘤穿透性，可以實現(xiàn)腫瘤快速高攝取并長時間滯留，同時仍具有穩(wěn)定的高親和性，但缺乏良好的腫瘤血池比，在注射后120 h僅為（1.10±0.12）。低分子量核素探針則由于較小的分子量具有更強的腫瘤穿透性，而且可實現(xiàn)注射當天進行顯像，但低分子量核素探針的親和力相比特異性單抗較弱。因此，在目前報道的PD-1/PD-L1靶向核素探針基礎(chǔ)上，研發(fā)可與PD-1/PD-L1高親和性特異性結(jié)合的低分子量核素探針，將是未來研究的重要方向。這將實現(xiàn)探針注射后短時間內(nèi)對患者進行SPECT或PET顯像的同時，對患者體內(nèi)PD-1/PD-L1表達的高度特異性檢測，將為腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用提供更方便的影像學檢查方法。

綜上，PD-1/PD-L1靶向核素分子探針可以無創(chuàng)、重復檢測全身包括腫瘤及其他組織中PD-1/PD-L1的表達水平，監(jiān)測治療過程中患者PD-L1表達的變化，有望成為篩選PD-1/PD-L1治療獲益患者的重要手段。但目前報道的臨床研究尚少，仍需大量的臨床研究驗證該檢查方法應(yīng)用于臨床的有效性。