Notch信號通路可通過激活Slug調(diào)控骨肉瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

陳敬騰，余鈴，方碩，郭良煜，郭衛(wèi)春

0 引言

骨肉瘤是最常見的間葉組織來源的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，預(yù)后差[1-2]。自20世紀70年代以來，化療和保肢手術(shù)的進展提高了骨肉瘤患者存活率，但并發(fā)化療耐藥和肺轉(zhuǎn)移使患者5年生存率不足20%[3-4]，給患者帶來了巨大痛苦和經(jīng)濟負擔，因此亟需尋求新的治療方案。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮細胞失去極性，減少細胞-細胞黏附獲得遷移和侵襲而成為間充質(zhì)細胞的生物學(xué)過程[5]。研究表明多種轉(zhuǎn)錄因子（Snail/Slug、Zeb1/2及Twist1/2等）參與該過程，并伴隨細胞-細胞黏附分子E-cadherin減少，波形蛋白vimentin、N-鈣黏蛋白N-cadherin和平滑肌肌動蛋白等可塑蛋白含量增多[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤出現(xiàn)侵襲與轉(zhuǎn)移時也伴隨EMT發(fā)生，然而促使腫瘤發(fā)生EMT的因素有很多，包括轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)、上皮表型蛋白丟失及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的開放等，目前機制尚不清楚[7-9]。

Notch信號通路在進化過程中高度保守，與細胞的增殖、分化與凋亡有重要關(guān)系[10]。研究表明Notch信號通路介導(dǎo)多種腫瘤細胞EMT過程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移過程有著密切的關(guān)系[11-13]，包括骨肉瘤[14]，但Notch信號通路對骨肉瘤EMT調(diào)控機制尚不清楚，仍需進一步研究。

本研究通過調(diào)控Notch信號通路活性進行體外、體內(nèi)實驗，研究其調(diào)控骨肉瘤EMT的具體機制，旨在通過激活和關(guān)閉Notch信號通路，檢測其對骨肉瘤EMT的影響；系統(tǒng)探索Notch信號通路對轉(zhuǎn)錄因子Slug的調(diào)控在骨肉瘤EMT過程中的作用及機制，以期為治療骨肉瘤提供新策略和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人骨肉瘤細胞143B細胞系由中國科學(xué)院上海生物研究所提供，慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，DMEM高糖和DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，新生胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）購自澳洲Gibco公司，青/鏈霉素及嘌呤霉素購自杭州吉諾公司，磷酸鹽（phosphate buffer saline,PBS）緩沖液購自美國ExCell Biology公司，二甲基亞砜購自上海久億化學(xué)試劑有限公司，DAPT及B27購自美國Sigma公司，表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）購自美國BioLegend公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司。qRT-PCR試劑盒購自日本YOYOBO公司，Western blot試劑盒購自中國生工生物工程（上海）股份有限公司，Slug購自美國Abcam公司，細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，紫外分光光度計購自英國Genova Nann公司，熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人骨肉瘤143B細胞溫浴培養(yǎng)于10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%新生胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素）中，每3天更換新鮮培養(yǎng)基，并于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞鋪滿90%培養(yǎng)瓶時，采用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代培養(yǎng)至對數(shù)期。

取對數(shù)生長期143B 骨肉瘤細胞接種于由DMEM/F12（1:1）、B27（2%）、EGF（20 ng/ml）和bFGF（20 ng/ml）組成的無血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

在室溫下融化慢病毒顆粒，使用前輕輕混勻，向培養(yǎng)液中加入慢病毒顆粒以感染細胞。輕輕震動培養(yǎng)板使其混勻并孵育過夜，于第3天移去培養(yǎng)液并添加5 ml新鮮培養(yǎng)基，第4天按1:3～1:5傳代并在培養(yǎng)基中添加嘌呤霉素篩選培養(yǎng)14天。將骨肉瘤143B細胞根據(jù)感染病毒種類的不同分為三組：感染NICD1過表達慢病毒（NICD1-OE組），shRNA慢病毒（RBPJ-shRNA組）和對照慢病毒（CON組）。

1.4 Western blot分析蛋白表達變化

用細胞裂解液提取處理后的骨肉瘤143B細胞細胞質(zhì)蛋白，BCA法進行蛋白定量。吸取40 μg蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入相應(yīng)—抗4℃孵育過夜。經(jīng)三乙醇胺緩沖鹽+Tween 20溶液漂洗3次后，采用1:3 000辣根過氧化物酶二抗室溫孵育2 h。在暗室中將PVDF膜用發(fā)光劑顯色曝光分析結(jié)果。以目的蛋白與β-actin的灰度比值表示蛋白表達水平。

1.5 免疫熒光染色觀察EMT標記E-cadherin和N-cadherin蛋白

將玻片在酒精燈上過火，放入24孔板中，消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1～2遍。重懸后以5×105個/毫升的密度接種入24孔板中，取無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理2 h，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000配制質(zhì)粒懸液，混勻，靜置20 min后加入孔中。8 h后換含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3天。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2～3遍，冰上處理。加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次×3 min，0.3%Triton-X-100室溫通透20 min。PBS洗3次×3 min，吸水紙吸干PBS，滴加山羊血清，室溫封閉30 min。棄去血清，滴加1%牛血清白蛋白稀釋的一抗E-cadherin（1:200稀釋）和N-cadherin（1:200稀釋），4℃過夜。次日，棄去一抗，PBS洗3次×5 min，加入熒光二抗，避光孵育1 h。DAPI復(fù)染細胞核6 min，避光，PBS洗3次×5 min。取出玻片，載玻片加防熒光淬滅封片劑，將玻片細胞片貼于載玻片上，熒光顯微鏡觀察并拍攝照片。

1.6 qRT-PCR檢測基因表達的變化

分別按照TRIzol總RNA提取試劑盒和Fermentas提供的RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒操作方案提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。利用序列檢測系統(tǒng)ABI PRISM 7 000進行序列擴增。熱循環(huán)條件為50℃ 2 min、95℃ 10 min、59℃ 1 min，95℃、15 s進行40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參。

1.7 TranswellTM侵襲實驗

用無血清的DMEM培養(yǎng)基按體積1:3稀釋Matrigel，將TranswellTM小室放入24孔板中，上室加入50 μl稀釋后的Matrigel，于37℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸出Matrigel表面液體。收集骨肉瘤143B細胞，用胰蛋白酶消化并重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×105個/毫升，上室加入200 μl細胞懸液，下室加入500 μl含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液。于37℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，棉簽擦去未侵襲的細胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，晾干后加入結(jié)晶紫染色10 min，PBS漂洗3次，晾干后于正置光學(xué)顯微鏡下觀察濾膜底附著的細胞數(shù)。每組隨機選取5個視野（×200），計數(shù)每個視野穿過的細胞數(shù)。每組實驗均獨立重復(fù)3次。

1.8 劃痕實驗

取傳代一致的細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103個/毫升，接種于6孔板，采用10 μl微量加樣槍頭劃出無細胞區(qū)。采用磷酸緩沖液吸取劃痕后脫落的細胞并進行拍照。培養(yǎng)24及48 h，分別拍照，觀察細胞遷移能力。細胞遷移率（%）=（0 h劃痕距離-24 h（或48 h）劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.9 siRNA轉(zhuǎn)染

143B細胞和NICD1-OE細胞傳代培養(yǎng)，生長至50%融合后，以7×108個/毫升的密度接種至6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜。根據(jù)轉(zhuǎn)染細胞不同將實驗分成4組：對照組（con組）、空白對照組（blank組）、無關(guān)siRNA處理組（mock組）、Slug siRNA處理組（siRNA組）。轉(zhuǎn)染以每孔為例：取5 μl 20 nmol/L的siRNA儲存液（ERK1/2siRNA（購自Santa Cruz公司，#sc-29307,50 nmol/L）或陰性對照siRNA（購自Santa Cruz公司，#sc-37007,50 nmol/L），Slug siRNA（廣州銳博公司合成，Gen Bank accession No.AK223368。Sense：5’-GATCCGACTACAGTCCAAGGTTTCTTCAAGACGTTGATGTCAGGTTCGAAAGTTTTTGAATTCA-3’；antisense：3’-C TA GGCTGATGTCCAGGTTCGAAAGAAGTTCTGCAACTACAGTCCAAGCTTTCAAAAACTTAAGT-5’；100 nmol/L）與250 ml OPTIMEM培養(yǎng)基混合均勻成A液；取5 μl Lipofectamine2000與250 ml OPTIMEM培養(yǎng)基混合均勻成B液，分別室溫放置5 min，將A液和B液混合，室溫放置20 min，將混合液加入6孔板中，每孔加入無血清培養(yǎng)基至2 ml，培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換成完全培養(yǎng)基，按照實驗要求處理細胞，進行后續(xù)實驗。

1.10 體內(nèi)成瘤實驗

根據(jù)小鼠成瘤時注射細胞的不同，將雄性無胸腺裸鼠隨機分為三組：NICD1過表達組（NICD1組）、DAPT抑制劑組（DAPT組）和對照組（control組），6只/組，NICD1組于右背部皮下注射1×105個NICD1細胞。DAPT組于右背部皮下注射1×105個143B細胞，并給予DAPT處理：DAPT溶于DMSO中，腹腔注射給藥，每天10 mg/kg，連續(xù)1周。對照組于右背部皮下注射1×105個143B細胞，并給予相應(yīng)體積DMSO腹腔注射作為對照處理。

觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤形成情況。于第8周脫頸處死小鼠，測量小鼠腫瘤的體積和重量。qRT-PCR檢測各組腫瘤組織中Slug、N-cadherin表達情況，所有動物實驗均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準（批準號20150419）。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSSl6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。計量資料間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch通路促進骨肉瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

采用慢病毒感染系統(tǒng)構(gòu)建了調(diào)控Notch通路NICD1表達的143B穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示NICD1-OE組NICD1表達量較CON組顯著上調(diào)（2.312±0.094vs.1.382±0.136,P=1.51E-06）。RBPJ-shRNA組NICD1表達量為0.364±0.055，與CON組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.52E-07），見圖1A～B。

免疫熒光染色結(jié)果顯示，E-cadherin的表達在NICD1-OE組與CON組中無明顯差異，而N-cadherin的表達較CON組顯著上調(diào)，且在RBPJ-shRNA細胞中下調(diào)，見圖1C。相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示NICD1-OE組細胞長/短軸比率為3.567±0.199，CON組為2.634±0.263，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.07E-06）。RBPJ-shRNA組長/短軸比率為1.269±0.202，與CON組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=2.68E-07），見圖1D。

Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，Slug相對表達量在NICD1-OE組、RBPJ-shRNA組和CON組分別為1.783±0.118、0.440±0.113和1.187±0.119，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（NICD1-OEvs.CON:P=0.0003;RBPJ-shRNAvs.CON:P=0.0097）；Twist相對表達量分別為1.420±0.095、0.291±0.089及0.990±0.191，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（NICD1-OEvs.CON:P=0.012;RBPJ-shRNAvs.CON:P=0.024），見圖1E～F。

2.2 Notch通路促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與CON組相比，RBPJ-shRNA組細胞的遷移率顯著降低，而NICD1-OE組細胞遷移率顯著增強，（24 h:NICD1-OEvs.CON,P=0.006;RBPJ-shRNAvs.CON,P=0.003。48 h:NICD1-OEvs.CON,P=0.04;RBPJ-shRNAvs.CON,P=0.007），見圖2A。

Transwell實驗結(jié)果顯示，與CON組侵襲細胞數(shù)目平均值（139.7±6.4個）相比，NICD1-OE組細胞（354.7±13.9個）的侵襲能力增強（P=0.023），而RBPJ-shRNA組細胞（90.0±10.4個）的侵襲能力減弱（P=0.001），見圖2B。

2.3 Notch信號通路促進骨肉瘤細胞體內(nèi)成瘤

小鼠注射骨肉瘤143B細胞后，與control組相比，NICD1組達到同樣腫瘤體積所需的成瘤時間縮短，DAPT組成瘤時間明顯延長，見圖3A。8周后NICD1組、control組和DAPT組腫瘤體積分別為（1715±127）、（633±42）和（104±14）mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（NICD1vs.control,P=0.002;DAPTvs.control,P=0.0005），見圖3B；三組腫瘤重量分別為（2080.0±45.8）、（693.3±15.3）和（617.0±13.5）mg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（NICD1vs.control,P=0.0001;DAPTvs.control,P=0.0029），見圖3C。

qRT-PCR結(jié)果顯示，NICD1組Slug和N-cadherin在離體骨肉瘤組織內(nèi)的表達量明顯升高，DAPT組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Slug:NICD1vs.control:P=3.28E-05,DAPTvs.control:P=0.002;N-cadherin:NICD1vs.control:P=5.35E-08,DAPTvs.control:P=0.002），見圖3D～E。

2.4 敲除Slug可反轉(zhuǎn)Notch信號通路對骨肉瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控作用

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，敲除Slug基因后blank組和mock組中Slug相對表達量分別為1.010±0.099和1.068±0.042，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.612）；siRNA組Slug相對表達量為0.135±0.024，與mock組相比顯著降低（P=0.0004），見圖4A～B。

相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示siRNA組細胞長/短軸比率為3.735±0.137，mock組為2.593±0.239，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022），見圖4C。

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與mock相比，siRNA組細胞的遷移率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24 h，P=0.005;48 h,P=0.003），見圖4D。

圖1 Notch通路促進骨肉瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化Figure 1 Notch pathway promoted epithelial-mesenchymal transition of osteosarcoma cells

圖2 Notch通路促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲Figure 2 Notch pathway promoted migration(A) and invasion(B) of osteosarcoma cells

圖3 Notch通路促進骨肉瘤細胞體內(nèi)成瘤Figure 3 Notch pathway promoted tumorigenesis in vivo of osteosarcoma cells

Transwell實驗結(jié)果顯示，mock組侵襲細胞數(shù)目平均值為335.2±13.0個，siRNA組為185.7±15.9個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0009），見圖4E。

3 討論

骨肉瘤生長迅速，早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移是目前世界上骨肉瘤相關(guān)致死的主要原因之一，研究骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移分子機制對治療骨肉瘤和提高患者生存率有重要意義。研究表明腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、多因素、多步驟、多階段、涉及多基因調(diào)節(jié)異常改變的生物學(xué)過程[15-18]。在此過程中上皮細胞原有的正常極性消失，并失去與基底膜連接的上皮細胞表型（E-cadherin、α-Catenin、β-Catenin等），從而獲得抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力及較高遷移與侵襲能力等間質(zhì)細胞表型（vimentin、纖維連蛋白、N-cadherin等）[15,19]。

圖4 敲除Slug可逆轉(zhuǎn)Notch信號通路對骨肉瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用FIigure 4 Slug knockout reversed regulatory effect of Notch signaling pathway on EMT of osteosarcoma cells

有研究顯示Notch信號通路參與腫瘤細胞EMT過程，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程有著密切的關(guān)系[20-21]。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)Notch信號通路對低濃度阿霉素誘導(dǎo)骨肉瘤細胞EMT發(fā)揮著重要作用，但具體機制尚未見報道。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染骨肉瘤143B細胞，成功獲得Notch信號通路激活或抑制的穩(wěn)轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞系，并進行體內(nèi)外實驗研究。在體外實驗中，通過免疫熒光染色觀察EMT相關(guān)標志物E-cadherin及N-cadherin的表達，N-cadherin表達在Notch信號通路激活組顯著升高，在抑制組顯著下調(diào)；而E-cadherin表達在各組間并無顯著變化，與Fang等[22]研究結(jié)果一致。觀察各組細胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路激活后細胞形態(tài)呈梭形，長短軸比率顯著升高。應(yīng)用qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示Slug和Twist表達在Notch信號通路激活后顯著上調(diào)，并且Slug表達量更高。以上表明Notch信號通路激活能夠促進骨肉瘤上皮細胞轉(zhuǎn)化。然后我們通過細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗觀察各組骨肉瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路激活后骨肉瘤侵襲和遷移能力顯著增強，而在通路抑制后侵襲和遷移能力顯著降低。

為探討Notch信號通路激活后的骨肉瘤細胞體內(nèi)致瘤作用，我們開展了動物實驗，于小鼠右背部皮下注射成瘤細胞，選取瘤體大小較一致的老鼠，剔除未接種成功的老鼠。成瘤實驗結(jié)果表明小鼠成瘤率為70%～80%，Notch信號通路激活組腫瘤生長速度更快，腫瘤的體積和重量顯著增大。對離體的腫瘤組織進行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Notch信號激活組的EMT標記蛋白Slug和N-cadherin表達量顯著升高，進一步證實Notch信號通路激活對骨肉瘤EMT具有促進作用。

為進一步探討Notch信號通路激活促進骨肉瘤EMT的具體機制，我們利用RNAi技術(shù)敲除Slug基因，得到Slug基因缺失的骨肉瘤細胞系。對此細胞系進行相差顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其細胞長/短軸比率較未敲除Slug的NICD1-OE組細胞降低，形態(tài)上偏球形。細胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除Slug基因后，骨肉瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力都有所減弱，表明抑制Slug表達可以反轉(zhuǎn)Notch信號通路激活誘導(dǎo)的EMT表型。

綜上可知，Notch信號通路激活后可通過調(diào)控Slug表達促進骨肉瘤EMT，影響細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，靶向調(diào)控Slug表達或者其他EMT轉(zhuǎn)錄因子可能有助于阻止骨肉瘤在患者體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移或惡化，為臨床治療骨肉瘤提供新的策略。