肝、 肝癌及肝纖維細胞的熒光光譜及其熒光飽和強度分析

胡 悅， 付 蕓， 李欣陽， 李永亮

長春理工大學(xué)光電工程學(xué)院， 吉林 長春 130022

引 言

肝癌始發(fā)于肝部細胞的癌變， 是死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。 肝癌早期癥狀不明顯， 常會發(fā)生貽誤病機的情況。 肝纖維化最早形成是因為肝臟發(fā)生炎癥而受損， 當肝臟炎癥逐漸加劇， 肝纖維化程度增加形成的肝臟瘢痕組織積聚時， 將會大大提高肝癌的發(fā)生概率。 肝纖維化因其引發(fā)原因復(fù)雜， 暫無明確檢測方式。 熒光光譜技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在多種疾病及腫瘤檢測過程中。 熒光光譜技術(shù)由于其準確性高， 穩(wěn)定性強， 且方便易測等優(yōu)勢[2]， 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。 細胞病變過程會產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物， 肝纖維及肝癌細胞內(nèi)光敏物質(zhì)受到激發(fā)后， 產(chǎn)生不同譜線形狀或強度的熒光光譜， 由此分析肝纖維及肝癌細胞內(nèi)部代謝物質(zhì)的變化， 這是細胞自體熒光光譜用于生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)[3]。 本研究對比肝纖維及兩種肝癌細胞的熒光光譜與正常肝細胞的光譜差異， 并結(jié)合高斯多峰擬合、 流式細胞儀分析以及非線性擬合分析， 對比四種細胞研究了熒光飽和趨勢與細胞直徑的關(guān)系。 目的在于， 為實現(xiàn)肝癌及肝纖維早期篩查工作提供光譜學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器

熒光光譜儀選用FL6500測量細胞懸浮液， 狹縫的光譜帶寬為10.0 nm， 激發(fā)波長488 nm， 發(fā)射波長530～750 nm， 激發(fā)波長間隔1 nm， 平均時間0.1 s， 掃描速度600 nm·min-1。 比色皿規(guī)格選擇0.9 mL， 每次檢測后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗去除比色皿內(nèi)殘余樣液。 流式細胞儀選擇BD Accuri C6型號， 激發(fā)光源488 nm， 通道選擇FSC-H， SSC-H。

1.2 樣品制備

選用四種細胞分別為： 肝細胞 HL-7702[L-02]； 肝纖維細胞 LX-2； 肝癌細胞 HepG-2； 肝癌細胞 SMMC-7721(均采購于上海富衡細胞庫)。 培養(yǎng)體系選擇加入10%新生牛血清、 1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基， 置于37 ℃， 5%CO2飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱。 防止細胞生長代數(shù)影響， 選擇培養(yǎng)至一定數(shù)量的相同代數(shù)細胞。 對四種細胞分別計數(shù)， 配置細胞濃度為1.25×105， 2.5×105， 5.0×105， 1×106和2×106cells·mL-1細胞懸浮液， 每種濃度3組。 三組不添加細胞的PBS溶液， 用于去拉曼散射。 每種細胞分別配置200 μm細胞數(shù)為1×105cells的細胞懸浮液， 重復(fù)3組， 用于流式細胞實驗。

1.3 熒光數(shù)據(jù)處理

在對細胞懸浮液進行檢測時， 會受到很多因素的影響， 包括溫度、 細胞活性、 pH值等。 除此之外， 細胞懸浮液中的PBS在激發(fā)光作用下會發(fā)射出拉曼光， 產(chǎn)生背景噪聲[4]。 為了獲得細胞的熒光光譜， 需要去除PBS的發(fā)射譜影響， 如圖1所示， 細胞濃度是1.25×105cells·mL-1時拉曼散射對熒光光譜的影響。

圖1 拉曼散射對熒光光譜的影響

對獲得的熒光光譜結(jié)果， 均需要去除拉曼光的影響， 如圖2所示， 圖2(a—d)分別為去除拉曼光譜影響后， 五種濃度下肝細胞、 兩種肝癌細胞、 肝纖維細胞的自體熒光光譜。

1.4 高斯多峰擬合

高斯多峰擬合法能夠精確給出熒光峰的位置， 每個單峰的展寬和強度值， 適用于對熒光光譜圖進行精確分析。 還可以結(jié)合高斯多峰擬合的相應(yīng)數(shù)值來判斷代謝物質(zhì)含量差異， 并根據(jù)獲得的最大峰值， 分析細胞熒光飽和強度趨勢變化。 圖3(a—d)分別是對5.0×105cells·mL-1濃度下四種細胞的高斯多峰擬合結(jié)果。 表1， 表2， 表3， 表4分別為四種細胞的高斯多峰擬合參數(shù)。

圖2 5種細胞5個不同濃度的自體熒光光譜

(a): hepatic cell HL-7702[L-02] (b): hepatoma carcinoma cell HepG-2; (c): Hepatic fibrosis cell LX-2; (d): hepatoma carcinoma cell SMMC-7721

圖3 (a)： Hl的高斯多峰擬合； (b)： Hep的高斯多峰擬合； (c)： Lx的高斯多峰擬合； (d): SMMC的高斯多峰擬合

Fig.3 (a): Gauss multi-peak fitting of HL; (b): Gauss multi-peak fitting of Hep; (c): Gauss multi-peak fitting of LX; (d): Gauss multi-peak fitting of SMMC

1.5 流式數(shù)據(jù)處理

利用流式細胞儀分析肝纖維、 肝癌細胞及正常肝細胞， 能夠獲得前向角散射光和側(cè)向角散射光雙參數(shù)散點圖， 如圖4所示， 為肝癌細胞Hep的流式細胞結(jié)果圖。 前向散射角與細胞直徑平方密切相關(guān)， 選擇FSC作為閾值可以排除樣品碎片以及鞘液中小液滴的干擾[5]。 利用圖像輔助流式細胞儀， 可以一次觀察大數(shù)量細胞情況， 圖中每個點均代表一個細胞， 通過分析橫軸SSC-H、 縱軸FSC-H細胞群落分布及聚集狀態(tài)， 可以分析四種細胞直徑特點[6]。

表1 HL的高斯多峰擬合參數(shù)

表2 Hep的高斯多峰擬合參數(shù)

表3 LX的高斯多峰擬合參數(shù)

表4 SMMC的高斯多峰擬合參數(shù)

圖4 Hep的流式細胞散點圖

2 結(jié)果與討論

2.1 自體熒光光譜分析

對細胞懸浮液進行熒光光譜檢測時， 需要考慮到PBS溶液拉曼散射的干擾， 如圖1所示， 需對結(jié)果進行去拉曼散射處理。

四種細胞懸浮液在488 nm波長的光激發(fā)下， 獲得特異性熒光發(fā)射譜。 3組平行實驗的結(jié)果近乎相同， 造成差異的原因可能是細胞懸浮液配置不均勻造成， 實驗先后順序不同， 此外， 細胞狀態(tài)有略微差異也會干擾實驗結(jié)果， 但結(jié)果具有可靠性。 如圖2所示， 為五種濃度細胞懸浮液的熒光光譜。 可以發(fā)現(xiàn)， 如圖2(a)所示， 肝細胞在550～750 nm之間存在兩個特異性熒光峰， 第一個峰值明顯高于第二個峰； 如圖2(b)和(d)所示， 肝癌細胞在550～750 nm之間存在三個特異性熒光峰， 第一個峰值最高， 第三個峰高于第二個峰； 如圖2(c)所示， 肝纖維細胞在550～750 nm之間存在三個特異性熒光峰， 第一個峰值最高， 第三個峰其次， 走勢和兩種肝癌細胞相似。 對比結(jié)果， 同種濃度下肝癌細胞最大熒光強度高于肝纖維細胞高于肝細胞。

結(jié)合高斯多峰擬合結(jié)果， 如圖3所示， 高斯多峰擬合效果貼近實驗所得譜線， 能夠?qū)Y(jié)果進行精確分析。 結(jié)合高斯多峰擬合參數(shù)， 如表1所示， 肝細胞第一個峰值位于592 nm處， 第二個峰位于682 nm處； 如表2， 表3， 表4所示， 肝癌， 肝纖維細胞除具有與肝細胞相同位置的兩個峰外， 在726 nm處存在第三個特異性熒光峰。 肝癌細胞和肝纖維細胞三個峰的展寬基本相同， 正常肝細胞最大激發(fā)峰展寬略小于另外三種細胞， 但是682 nm處的小峰展寬略大于病變細胞。 相同濃度下， 肝細胞兩個峰的熒光強度均低于另外三種細胞； 肝癌細胞三個峰的熒光強度略高于肝纖維細胞； 兩種肝癌細胞譜形相似， Hep的最大熒光強度略大于SMMC， 且726 nm處的熒光峰明顯高于SMMC。

結(jié)果說明， 肝癌和肝纖維細胞在代謝過程中， 產(chǎn)生了同種激發(fā)峰的代謝產(chǎn)物， 而正常肝細胞并不具備。 發(fā)生病變的細胞在代謝過程中， 不僅代謝物質(zhì)種類發(fā)生變異， 物質(zhì)含量變化也十分明顯。

細胞由于內(nèi)源性熒光物質(zhì)的差異， 熒光光譜形狀也會改變。 蛋白質(zhì)是細胞主要組成物質(zhì)， 占細胞干重的一半以上， 能夠在300～350 nm范圍顯示出強熒光[7]。 細胞中的脂褐素的最大激發(fā)波長為340～395 nm， 最大發(fā)射波長為540～640 nm。 內(nèi)源性卟啉是一種大共軛環(huán)狀結(jié)構(gòu)的金屬有機化合物， 具有很強的熒光， 原卟啉粉末在紅光區(qū)有三個熒光峰， 分別位于628， 727和762 nm附近[8]。 熒光光譜檢測結(jié)果顯示， 肝病變細胞與健康細胞的光譜差異可能與卟啉或卟啉類結(jié)合物的產(chǎn)生有關(guān)。

2.2 熒光飽和強度分析

在以往研究中發(fā)現(xiàn)細胞最大熒光強度的飽和現(xiàn)象與細胞大小相關(guān)。 圖4是利用流式細胞儀分析， 獲得的熒光信號分布圖， 圖上每一個點均代表一個細胞。 結(jié)果顯示四種細胞直徑比較集中， 肝細胞直徑明顯小于病變細胞， 肝癌細胞直徑最大， Hep細胞略大于SMMC細胞。

為了研究肝細胞、 肝癌細胞及肝纖維細胞的飽和程度趨勢， 可以通過高斯多峰擬合結(jié)果， 獲得每組細胞最大熒光強度， 并通過非線性擬合， 獲得最大熒光強度隨濃度變化曲線。 通過Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析處理， 系統(tǒng)比較了多個非線性擬合方程， 調(diào)整參數(shù)， 對比結(jié)果， 最終選擇了具有最佳非線性擬合效果的Exponential-exp3p1， 結(jié)果顯示Adj.R-Square值高達0.996， 擬合效果與預(yù)期相符。

對比細胞最大熒光強度隨濃度變化曲線， 如圖5所示， 橫軸表示不同濃度梯度， 縱軸表示不同濃度下的最大熒光強度， 對擬合曲線圖進行分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種細胞的最大熒光強度隨著細胞濃度增大而增強， 但是逐漸會呈現(xiàn)熒光飽和狀態(tài)， 單個細胞自激發(fā)熒光效率降低。 相比另外三種細胞， 肝細胞熒光飽和強度隨著濃度增大熒光強度增速降低， 明顯呈現(xiàn)出飽和趨勢， 但是飽和度相對較小。 兩種肝癌細胞和肝纖維細胞趨勢相近， 肝癌細胞熒光飽和程度高于肝纖維細胞， 飽和趨勢也更為明顯。 結(jié)合流式細胞結(jié)果， 細胞直徑越大， 熒光強度越大， 越容易呈現(xiàn)出熒光強度飽和的趨勢。

圖5 熒光飽和趨勢分析

3 結(jié) 論

對細胞懸浮液檢測時， 需除去拉曼散射對光譜的影響。 肝癌， 肝纖維細胞除具備與肝細胞相同位置的兩個峰外， 在726 nm處存在第三個特異性熒光峰。 同種濃度下兩種肝癌細胞熒光強度均高于肝纖維細胞高于肝細胞。 肝癌細胞直徑大于肝纖維細胞， 肝細胞直徑最小。 隨著濃度增加熒光強度增速降低， 逐漸呈現(xiàn)出明顯的飽和趨勢， 單個細胞自激發(fā)效率降低等現(xiàn)象。 并且細胞直徑越大， 同種濃度下獲得的最大熒光強度越大， 呈現(xiàn)出熒光飽和趨勢更為明顯。 本工作不僅探索了肝、 肝癌、 肝纖維細胞的熒光光譜特性， 還對比了細胞的直徑， 分析了熒光飽和強度變化趨勢， 為研究肝部病變的早期診斷和篩查提供了光譜學(xué)依據(jù)。

致謝： 感謝長春理工大學(xué)付蕓老師的指導(dǎo)； 感謝吉林大學(xué)張平老師提供細胞培養(yǎng)環(huán)境， 以及細胞培養(yǎng)過程的幫助和指導(dǎo)； 感謝長春應(yīng)化所化學(xué)生物實驗室高楠老師提供熒光光譜實驗指導(dǎo)。