油菜附加系EE抗根結(jié)線蟲的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究

余 萍，董 超，羅紅梅，Holger Budahn，張紹松*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223； 2.植物育種研究中心園藝作物研究所，德國 奎德林堡 06484)

【研究意義】根結(jié)線蟲 (Meloidogynespp.) 是世界性重要植物病原線蟲，也是中國農(nóng)作物最主要的病原線蟲[1]。其適應(yīng)性強，傳播途徑多樣，寄主范圍廣，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成嚴(yán)重的損失[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年因線蟲危害所造成的農(nóng)作物損失多達1000億美元，其中50 %的經(jīng)濟損失是由根結(jié)線蟲侵害造成的[3-4]。近些年，線蟲病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的一個問題?？刂聘Y(jié)線蟲目前應(yīng)用較廣的是殺線蟲劑，但在土壤及植株中殘留時間長，對生態(tài)環(huán)境破壞大，大多歐洲國家已經(jīng)禁止使用。因此，發(fā)掘和利用抗根結(jié)線蟲病的抗性資源是最有效、最經(jīng)濟的防控措施?！厩叭搜芯窟M展】抗根結(jié)線蟲的R基因已經(jīng)從多種植物中分離。第1個分離克隆的抗根結(jié)線蟲R基因是來源于番茄的Mi-1.2基因[5](Vos et al., 1998)，隨后，來源于馬鈴薯的Gpa2和Rmc基因[6-7]，番茄的Mi9基因[8](Jablonska et al., 2007)，櫻桃李的Ma基因[9](Claverie et al., 2011)，棉花的GHNTR1基因[10](Zhang et al., 2015)，基因甜椒的Me[11](Celik et al., 2016)等相繼被克隆。油蘿卜是十字花科蘿卜屬蘿卜的變種，具有優(yōu)良的抗病蟲基因，如抗根結(jié)線蟲和孢囊線蟲，及其它抗旱、抗寒、耐酸堿等優(yōu)良特性。已有研究表明抗甜菜胞囊線蟲基因Hs1Rph定位在油蘿卜D染色體上[12](Budahn et al., 2009)。另外，抗性測定結(jié)果顯示，油蘿卜E染色體攜帶該抗性基因[13](Zhang et al., 2014)。【本研究切入點】蛋白質(zhì)組學(xué)是一種前沿的方法，用于揭示蛋白質(zhì)的動態(tài)變化，以應(yīng)對不同的壓力因素，包括生物和非生物脅迫。以接種南方根結(jié)線蟲的油菜(感病)和油菜附加系EE(抗病)的根系為材料，通過蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)典的雙向電泳方法，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選差異表達的蛋白質(zhì)及預(yù)測它們間的關(guān)系，以找到與抗線蟲密切相關(guān)的蛋白質(zhì)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為培育抗性品種提供基因資源，并揭示植物-根結(jié)線蟲互作機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料和線蟲培養(yǎng)

以抗根結(jié)線蟲的油菜附加系EE和感根結(jié)線蟲的油菜Madora為材料。將該種植株的種子在育苗盤中播種。1個月后，將幼苗移植到9 cm× 9 cm的塑料盆中，該盆中含有400 g包括根結(jié)線蟲的病土。經(jīng)測定該病土主要含有南方根結(jié)線蟲和少量的花生根結(jié)線蟲，爪哇根結(jié)線蟲。 植物在氣候室18 ℃下培養(yǎng)16 h ，13 ℃，晝夜8 h，持續(xù)2個月。 收集根為樣品儲存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

參考Yu P等的方法[14]。即用TCA/丙酮法分別從3.0 g Madona和Madona ee根中提取總蛋白。使用Bradford方法[15]測定蛋白質(zhì)濃度。分別使pH 4～7的IPG膠條吸收含600 μg總蛋白質(zhì)的500 μl水化緩沖液(7 M尿素，2 M硫脲，4 %CHAPS，65 mM DTT，0.2 %IPG緩沖液，0.001 %溴酚藍)中。在IPGphor II中進行等電聚焦：250 V 30 min，500 V 30 min，1000 V 30 min，8000 V 4 h和8000 V 65000 Vh。聚焦完成后依次置于平衡緩沖液-1(6M尿素，2 %SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.8,20 %甘油，2 %DTT)和平衡緩沖液-2(6M尿素，2 %SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.8,20 %甘油，2.5 %碘乙酰胺)中分別平衡20 min。轉(zhuǎn)入含12.5 %SDS-PAGE凝膠的GE Ettan DAL Tsix儀器中垂直電泳。電泳后將凝膠用Coomassie Brilliant Blue G-250染色， UMAX Power Look掃描儀以300 dpi灰度模式分辨率掃描， Image Master 2D Platinum軟件5.0版(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，Sweden)進行分析。篩選出分離清晰且具有2倍或更多表達差異的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定。

1.3 質(zhì)譜鑒定

蛋白質(zhì)點經(jīng)胰蛋白酶酶解，提取和Ziptip脫鹽過程，然后取1 μl溶解樣品點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取0.6 μl過飽和CHCA基質(zhì)溶液點至對應(yīng)靶位上并自然干燥。樣品靶經(jīng)氮氣吹凈后放入儀器進靶槽并用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF, AB SCIEX)進行測試分析，激光源為波長349 nm 的Nd:YAG 激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級質(zhì)譜(MS)掃描范圍為800～4000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質(zhì)譜(MS/MS)分析，每個樣品點上選擇10個母離子，二級質(zhì)譜(MS/MS)累計疊加2500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。質(zhì)譜測試原始文件用Mascot 2.2軟件檢索NCBInr Brassica_rapa和Raphanus_sativus數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過GO(http://www.geneontology.org/)和WEGO(http://wego.genomics.org.cn/)進行顯著差異表達蛋白質(zhì)的功能注釋。 WOLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort)用于預(yù)測目標(biāo)蛋白的亞細胞定位。 KEGG(http://www.kegg.jp/)用于分析差異表達蛋白質(zhì)參與的代謝途徑。 STRING(http://www.string-db.org/)用于構(gòu)建差異表達蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達蛋白的鑒定

為了從蛋白水平揭示植物的抗線蟲機制，通過2-DE 和 質(zhì)譜技術(shù)研究油菜附加系EE和其供體油

菜Madora 根系差異表達蛋白。 選擇pH 4～7的IPG膠條和12.5 %的聚丙烯酰氨凝膠電泳分離植株根系總蛋白質(zhì)。利用Image Master 5.0分析2-DE掃描 圖譜。圖1顯示Madora和油菜附加系EE分別有 1184和1163 個蛋白點。 以Madora為對照，油菜附加系EE與其相比較，經(jīng)MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜成功鑒定了21個差異表達蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)表達量上調(diào)的有12個，下調(diào)的有9個(表1)。

圖1 植株根部的2-DE圖譜Fig.1 The 2-DE maps of plant roots

表1 MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜鑒定油菜附加系EE和油菜Madora根部差異表達蛋白質(zhì)

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 差異蛋白的生物信息學(xué)分析

為了闡明差異表達蛋白的功能，通過GO功能分類系統(tǒng)鑒定了這些蛋白的生物過程，分子功能和細胞成分。 結(jié)果表明這些蛋白主要分為細胞成分中的細胞，細胞部分和細胞器，分子功能中的結(jié)合和催化作用，生物過程中的細胞過程，代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)(圖2)。 WoLF PSORT預(yù)測了這些蛋白質(zhì)的亞細胞定位，其主要定位于細胞外(52.38 %)，其次是細胞質(zhì)(28.57 %)，葉綠體(4.76 %)，線粒體(4.76 %)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(4.76 %)，液泡(4.76 %，圖3)。

圖2 GO和WEGO的功能分類Fig.2 Functional classifications from GO and WEGO

圖3 鑒定蛋白質(zhì)的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of the identified proteins

通過STRING對所有差異表達的蛋白質(zhì)繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4)。 該圖顯示，胰蛋白酶抑制劑BvTI(Bra003850.1-P)，V型質(zhì)子ATP酶催化亞基A(Bra003633.1-P)和核苷二磷酸激酶1樣亞型X1(Bra030844.1-P)是獨立的，與其他蛋白質(zhì)無關(guān)。 然而，ATP合成酶β-2亞基(Bra028648.1-P)，蘋果酸脫氫酶1(Bra039662.1-P)，S-腺苷甲硫氨酸合成酶3(Bra023084.1-P)和S-腺苷甲硫氨酸合酶亞型X2(SAMS-P)4個蛋白質(zhì)具有一定的相關(guān)性。3-異丙基蘋果酸脫水酶大亞基(Bra032708.1-P)，微管蛋白α-6鏈(Bra018825.1-P)，表皮特異性分泌糖蛋白EP1(Bra035070.1-P)，內(nèi)源性α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑樣(Bra016070.1-P)，BnaC04g03560D(Bra004819.1-P)和BnaC06g3421 0D(Bra016002.1-P)6個蛋白質(zhì)具有一定的相關(guān)性。

圖4 差異表達蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein-protein interaction network of the differentially expressed proteins

為了明確差異表達蛋白參與的代謝途徑，KEGG用于確定它們屬于哪種類型的生化代謝途徑。結(jié)果顯示，共有7種蛋白質(zhì)參與代謝途徑，分別為XP_013676805.1和XP_013673398.1共同參與氧化磷酸化； XP_013748848.1參與檸檬酸循環(huán)，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙酮酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，光合生物中的碳固定和碳代謝等多種代謝途徑； XP_013723181.1和XP_013722790.1共同參與了氨基酸的生物合成；另外，核苷二磷酸激酶1樣亞型X1(XP_013649391.1)參與了MAPK信號通路；微管蛋白α-6鏈(XP_013640865.1)參與了吞噬體。

圖5 差異表達蛋白的KEGG途徑Fig.5 Images of differentially expressed proteins in KEGG pathway

3 討 論

植物寄生線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種常見的病原物，全球每年因植物寄生線蟲造成的農(nóng)作物損失約800億～1570億美元不等[16]。其中，危害最為嚴(yán)重的為根結(jié)線蟲。由于其非特異性、癥狀隱蔽、缺乏明顯損傷而常常被誤診或被忽視。

油蘿卜是十字花科蘿卜屬蘿卜的變種，具有優(yōu)良的抗生物脅迫和非生物脅迫的抗性基因。經(jīng)長期的雜交選育，已獲取9個油菜附加系。其中，油菜附加系EE是油蘿卜的E染色體以二倍體形式存在于油菜Madora中，用于研究單個油蘿卜染色體對抗性行為的影響。經(jīng)油菜附加系的抗性測定結(jié)果顯示，油蘿卜E染色體攜帶抗根結(jié)線蟲的基因[13]。因此，為了鑒定油蘿卜E染色體可能參與介導(dǎo)的抗性蛋白質(zhì)，將油菜附加系EE與油菜Madora進行比較。21個蛋白質(zhì)被成功鑒定，其中12個蛋白質(zhì)上調(diào)。上調(diào)的蛋白質(zhì)中，4個蛋白質(zhì)被鑒定為kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑DrTI，3個蛋白質(zhì)為內(nèi)源性α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑。

蛋白酶抑制劑廣泛分布于自然界中，特別是植物的貯藏器官，如種子和塊莖中，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡并保護植物免受昆蟲、線蟲和微生物等病原體的侵害[17]。絲氨酸蛋白酶抑制劑是最多樣化的蛋白酶抑制劑超家族，在許多生物過程中扮演著重要角色，例如血液凝固，纖維蛋白溶解、發(fā)育、炎癥、組織損害、免疫防御、酚氧化酶原激活和脊椎動物、無脊椎動物的補體系統(tǒng)[18]。Kunitz型蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸家族，幾乎所有生物中都存在，通過調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的蛋白水解活性，參與免疫反應(yīng)預(yù)防血吸蟲病[19]。α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑為雙功能抑制劑，具有抑制蛋白酶和內(nèi)源性α-淀粉酶的作用，大量存在于植物種子中，在水稻、大麥、小麥等多種植物中已有報道，具有參與針對微生物的植物防御系統(tǒng)[17]。該基因在大麥發(fā)育中的果皮中特異性表達表明該蛋白質(zhì)主要與種子對病原體的防御有關(guān)。 該蛋白可能通過特異性的抑制大麥α-淀粉酶的作用使真菌無法獲取種子的淀粉[20]。首次在中草藥川芎根莖中發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑，并研究表明該基因?qū)D(zhuǎn)基因工程有用，以提高植物對害蟲和微生物的抗性[21]。

本研究表明Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑和α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑在接種根結(jié)線蟲的油菜附加系EE中均上調(diào)，上調(diào)幅度最大的可達13.52倍。說明這2種蛋白酶抑制劑可能在油菜附加系EE抗根結(jié)線蟲過程中起著重要作用。將蛋白酶抑制劑制成的生物農(nóng)藥或轉(zhuǎn)基因植物用于防治根結(jié)線蟲能有效減少化學(xué)殺線劑的使用，改善環(huán)境和維持生態(tài)平衡。

為了進一步驗證蛋白酶抑制劑參與抗線蟲機制，應(yīng)在線蟲感染到卵塊發(fā)育的時間范圍內(nèi)更詳細地測量它們的表達水平。 同時，應(yīng)用細胞學(xué)方法研究進食位點的發(fā)育。

4 結(jié) 論

油菜附加系EE通過調(diào)節(jié)參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白酶抑制劑的表達量上調(diào)和表皮特異性分泌糖蛋白、微管蛋白等蛋白質(zhì)表達量的下調(diào)作用抵抗根結(jié)線蟲的侵染。