草果水提物對洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘癥狀的影響

楊偉倩，田 洋，張愛靜，常松林，孫 娜，高曉余，范源洪

(1.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201；2.云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；4.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】近年來由于人類飲食和生活方式的變化，功能性便秘愈發(fā)常見，逐漸成為降低人們生活品質(zhì)的重要因素之一[1]。便秘患者表現(xiàn)出排便障礙，如排便時間過長、大便硬化、繼發(fā)于腸道的排便疼痛，腹痛等[2-3]。目前，滲透性或分泌型瀉藥通常用于緩解便秘，這些療法經(jīng)常失敗或僅有短期的療效并誘導(dǎo)副作用[4]。因此，迫切需要一類新型的便秘無危害治療方法?！厩叭搜芯窟M展】一些生物活化劑能夠通過促進腸道運動來改善便秘癥狀且副作用較少而受到更多關(guān)注。譬如，來自滸苔的多糖被發(fā)現(xiàn)可以改善小鼠的便秘[5-6]，而細菌纖維素可有效緩解大鼠便秘[7]。這些研究為便秘治療提供了一些有趣的想法和材料來源。中國藥典(2010年版)記載，草果主產(chǎn)于云南、廣西等中國西南地區(qū)，是由姜科豆蔻屬植物草果(Amomumtsao-ko)的成熟果實干燥而成，具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效[8]。目前，草果被證明具有一系列的生物和藥理活性，如草果水提取物具有很強的抗乙型肝炎病毒效果，揮發(fā)油可增加胃粘膜血流量，血清胃泌素水平升高，抗自由基對胃黏膜損傷的活性增強[9]。有研究表明，草果具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗肥胖活性[10]。草果在民間主要被用于治療瘧疾、消化不良、胃功能失調(diào)、腹痛惡心、腹瀉和咽喉感染等病癥[11]。且有報道稱，草果單用，對于腹脹的治療、消食化積的作用十分顯著[12]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，尚未有關(guān)于草果水提物對功能性便秘影響的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為明確草果水提物是否可以促進便秘小鼠腸道蠕動從而緩解便秘癥狀，對草果水提物潤腸通便功效進行動物試驗研究，以期為草果資源的開發(fā)利用和通便功效機制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草果，產(chǎn)地云南。

昆明種小鼠72只，體重18～22 g，昆明醫(yī)科大學(xué)提供，SPF級。

洛哌丁胺購自Sigma；麻仁丸購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。

洛哌丁胺的配制：將20 mg洛哌丁胺溶于25 mL 0.9 %生理鹽水中至終濃度為8 mg·mL-1。

麻仁丸混懸液的配制：將麻仁丸(6 g·丸-1)溶解在0.9 %生理鹽水中至終濃度為60 mg·mL-1[13]。

墨汁的制備：準確稱取100 g阿拉伯樹膠加入800 mL水，將溶液煮沸至透明，加入50 g活性炭，將溶液煮沸3次。當溶液冷卻后，用水稀釋至1000 mL[14]，然后在4 ℃下儲存并在使用前混勻。

1.2 方法

1.2.1 草果水提物的制備 準確稱取400 g草果粉，以料液比1∶9(m∶V)加入3600 mL煮沸的超純水于燒杯，混勻后沸水煮1 min，立即過濾。過濾后，將濾液于低速離心機連續(xù)離心3次(4500 r/min 5 min)，取上清液。將濾渣倒入煮沸的3600 mL UP水混勻后煮1 min，立即過濾。重復(fù)上述操作2次。將3次離心后的上清液進行真空冷凍干燥。

1.2.2 動物分組及給藥 試驗設(shè)500、750、1000 mg·kg-1·d-13個草果水提物劑量組(n=12)；同時分別設(shè)1個正常對照組、陽性對照組和便秘模型組(n=12)。樣品用0.9 %生理鹽水配成所需濃度?？瞻捉M灌胃0.9 %生理鹽水；模型組灌胃8 mg·kg-1·d-1洛哌丁胺；陽性組灌胃900 mg·kg-1·d-1的麻仁丸混懸液；3個劑量組分別灌胃相應(yīng)濃度受試物和洛哌丁胺(8 mg·kg-1·d-1)。每日經(jīng)口灌胃 1 次容量均 0.2 mL·10g-1體重，連續(xù)7 d。

1.2.3 排便試驗 藥物干預(yù)的第6天晚上，對各組小鼠采取撤食但不撤水處理。禁食12 h后(第7天上午)，給空白組小鼠灌胃生理鹽水，其他組分別灌胃洛哌丁胺和相應(yīng)受試物。30 min后，灌胃墨汁并開始計時。將每只小鼠單獨置于籠內(nèi)，自由飲水，記錄每只小鼠排出的首粒黑便時間，統(tǒng)計6 h內(nèi)小鼠排出的糞便數(shù)量和重量[15]。觀察結(jié)束后，立刻收集糞便樣品并在60 ℃干燥至恒重，根據(jù)以下公式計算糞便含水率。

糞便含水率(%)= [糞便濕重(g)-糞便干重(g)]/糞便濕重(g)×100

1.2.4 小腸運動試驗 藥物干預(yù)的第7天晚上，同樣對各組小鼠采取撤食但不撤水處理12 h。第8天上午，給空白組小鼠灌胃生理鹽水，其他組分別灌胃洛哌丁胺和不同濃度的受試物。30 min后灌胃墨汁作為指示劑，20 min后，采用二氧化碳吸入法處死小鼠，隨即打開腹腔，取出腸道，小心去除腸系膜，收集胃和回盲腸連接部分的小腸段，并測量其長度。測量從幽門到墨汁前沿的距離作為墨汁的推進距離，按下列公式計算墨汁推進率[16]。

墨汁推進率(%)=墨汁的推進距離/小腸的全長×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad prism 5.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用獨立T檢驗(兩尾法)分析首粒黑便時間、墨汁推進率、6 h糞便重量、數(shù)量和糞便含水率等參數(shù)在空白組、給藥組與模型組間的差異顯著性。在小鼠便秘模型建立成功前提下，即模型組與空白組差異性顯著(P<0.05)，草果水提物處理組與模型組間只要有上述1項指標差異性顯著，即可認為草果水提物具有潤腸通便功效[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果水提物對便秘小鼠基礎(chǔ)機體指標的影響

草果水提物等受試物干預(yù)過程中小鼠的體重變化、飲食量和飲水量以及小鼠處死后的肝臟、盲腸臟器系數(shù)等基礎(chǔ)指標結(jié)果如圖1所示。試驗期間各組小鼠體重在正常范圍內(nèi)浮動，攝食量、飲水量以及各臟器系數(shù)各組間亦無顯著性差異(P>0.05)。說明各受試物未對小鼠的攝食、飲水等基礎(chǔ)機體指標造成較大影響。

體重變化(A)、飲食量(B)2 d監(jiān)測1次；飲水量(C)4 d監(jiān)測1次，取平均值。肝臟(D)和盲腸重量(E)與體重之比在小腸運動試驗后測得The body weight (A) and food intake (B) were monitored once every two days. The water consumption (C) was monitored once every four days, taking the average. The ratio of liver to body weight (D) and the ratio of cecum to body weight (E) were measured after small intestinal movement

2.2 草果水提物對便秘小鼠排便參數(shù)的影響

為確定草果水提物的通便作用，在草果水提物等受試物干預(yù)的第7天進行排便試驗，觀察記錄每組小鼠的首粒黑便時間、糞便重量和粒數(shù)和6 h的糞便含水率。如圖2所示，與空白組比較，模型組的首粒黑便平均時間從170 min延長至230 min，6 h糞便重量下降了0.3 g，糞便粒數(shù)減少8粒，6 h糞便含水率下降了20 %，差異性均達極顯著水平(P<0.01)，表明小鼠便秘模型建立成功。

干預(yù)的第7天通過觀察、分析獲得小鼠首粒黑便時間(A)，6 h糞便重量(B)，糞便粒數(shù)(C)和糞便含水率(B)。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001On the seventh day, recorded the first black fecal time (A), the fecal pellet number (B), the fecal weight (C) and the fecal water content (D) in 6 hours. Compared with the control,*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001. Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001

與模型組相比，草果水提物高劑量組小鼠的首粒黑便時間減短至180 min，差異性顯著(P<0.05)；6 h糞便重量增加0.2 g，糞便粒數(shù)增加5粒，糞便含水率增加15 %，差異性均達極顯著水平(P<0.01)。同時，中劑量草果水提物亦顯著增加了小鼠6 h排便重量、粒數(shù)和糞便含水率。表明，中高劑量的草果水提物均可顯著改善小鼠的便秘癥狀，高劑量改善效果更好。

2.3 草果水提物對便秘小鼠小腸蠕動的影響

腸道內(nèi)容物在小腸內(nèi)的蠕動速度即胃腸道的轉(zhuǎn)運率是評價受試物潤腸通便效果的重要指標之一。小腸運動試驗中所得小腸長度以及墨汁推進率用于判斷草果水提物對便秘小鼠胃腸道轉(zhuǎn)運率的影響。由圖3-A可知，各組小鼠小腸長度差異性不顯著(P>0.05)；因此，可排除其對小腸運動試驗結(jié)果的影響。模型組的墨汁推進率比空白組顯著減少40 %，兩組間差異性極顯著(P<0.001)，表明便秘模型成立。草果水提物中、高劑量組小鼠的墨汁推進率與模型組相比顯著增加20 %(P<0.05)、40 %(P<0.001)，表明草果水提物可以通過促進便秘小鼠小腸蠕動從而緩解便秘。

干預(yù)的第8天，經(jīng)墨汁灌胃20 min后，小鼠小腸長度(A)和胃腸道轉(zhuǎn)運率(B)。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001On the eighth day, small intestine length (A), and gastrointestinal transit ratio(B) were observed in 20 min later after gavaging black ink of constipated mice. Compared with the control,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001. Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

天然植物和產(chǎn)品因其有效性和相對安全性而作為治療便秘的候選成分而備受關(guān)注[18]。草果是一種具有特殊風味的藥食同源植物。但目前，中國超90 %的草果都作為輔料添加到食品中，在其他研究領(lǐng)域以及藥品配制中的應(yīng)用不足10 %[19]。草果含有豐富的營養(yǎng)成分，如糖類、膳食纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、油脂、花青素等[20]。膳食纖維，被人體消化酶顯示不易消化，并經(jīng)結(jié)腸細菌菌群消化，產(chǎn)生各種終產(chǎn)品，包括短鏈脂肪酸(主要為乙酸鹽，丙酸鹽和丁酸鹽)、氣體(氫氣，甲烷，二氧化碳)以及維持細菌生長的能量[21]。其中，短鏈脂肪酸已被證明可以促進結(jié)腸蠕動[22]。不溶性纖維在增加糞便重量和持水力方面特別有效。草果是具有抗氧化和抗炎活性的生物活性成分的有效來源[23]。這些證據(jù)證明，草果具有緩解便秘的物質(zhì)基礎(chǔ)，但其作用效果及潛在的作用機制尚不清楚。研究草果水提物對便秘癥狀的改善作用，是首次作為具有生物活性的植物源來探究其對便秘的改善作用。

便秘是一種常見的腸道問題，其主要臨床癥狀包括排便困難、排便次數(shù)減少、大便干燥和堅硬[24]。研究中使用首粒黑便時間、6 h糞便含水率、糞便重量、數(shù)量和墨汁推進率評價草果水提物對便秘小鼠癥狀的改善作用。胃腸內(nèi)容物的蠕動主要通過測量墨汁推進率來檢測。研究表明，草果水提物可以通過促進小腸蠕動來緩解便秘。糞便和排便特征可以直接反映便秘，因為糞便在腸道中的保留時間長且水的過度吸收可導(dǎo)致糞便干硬，增加排便困難。本研究中，首粒黑便時間和6 h糞便含水率、糞便重量和數(shù)量提供了草果水提物改善便秘癥狀的直接證據(jù)，即草果水提物可以通過縮短首粒黑便時間和增加糞便含水量、數(shù)量和重量來緩解便秘。

本試驗秉承實驗動物的“3R”原則，即1959年動物學(xué)家Russell和微生物學(xué)家Burch提出的Reduction (減少)、Replacement (替代) 和Refinement (優(yōu)化)[25]，在確保實驗結(jié)果不受影響的前提下，盡量減少實驗動物的數(shù)量以減輕其痛苦[26]。在前期試驗基礎(chǔ)上，選用72只昆明種小鼠受試8 d，在第7和8天連續(xù)開展排便試驗和小腸運動試驗，與模型對照組相比，中、高劑量草果水提物可以顯著提高便秘小鼠的胃腸道轉(zhuǎn)運率，縮短首粒黑便時間，增加6 h排便數(shù)量、重量及其糞便含水率。因此，可以認為草果水提物可顯著改善洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘癥狀，具有潤腸通便的功效。

滲透性和容積性的瀉藥是目前用于便秘治療的主要藥物，這些藥物在減輕部分患者便秘癥狀的同時會產(chǎn)生一些副作用，甚至會形成藥物依賴從而對健康造成威脅。試驗過程中，低、中、高劑量草果水提物(500、750、1000 mg·kg-1·d-1)均沒有引起小鼠體重、攝食等機體指標的異常變化，亦沒有出現(xiàn)腹瀉、精神狀態(tài)不佳等明顯副作用癥狀，表明草果水提物的潤腸通便作用溫和。麻仁丸是具有潤腸通便功效的復(fù)方制劑，由麻子仁、杏仁、大黃、厚樸、枳實及芍藥等中藥組成[27-28]，是一種成熟的治療便秘的中藥。本試驗結(jié)果表明，高劑量的草果水提物干預(yù)后，便秘小鼠的排便參數(shù)和小腸運動結(jié)果都與陽性藥物麻仁丸非常接近。這些證據(jù)證明，草果水提物可以溫和地改善便秘，但對草果水提物改善便秘癥狀的有效成分和作用機制尚不清楚。

4 結(jié) 論

通過小鼠排便和小腸運動試驗研究發(fā)現(xiàn)，與洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘模型小鼠相比，中、高劑量草果水提物(750、1000 mg·kg-1·d-1)干預(yù)組的小鼠胃腸道轉(zhuǎn)運率得到顯著提高，首粒黑便時間顯著地縮短，6 h糞便含水率、糞便數(shù)量和重量顯著增加。據(jù)此，草果水提物可顯著改善洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘癥狀，具有可靠、溫和的潤腸通便功效。本研究首次報道了草果水提物可以通過促進小腸蠕動來溫和有效的緩解便秘癥狀。