豬鏈球菌2型通過誘導(dǎo)IFN-γ促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬破壞血腦屏障完整性

劉嘉楠，賈 麗，姜合祥，吳 桐，李 揚(yáng)，雷連成,3*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué) 護(hù)理學(xué)院， 吉林 長春 130062；3.長江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023 )

由豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2，SS2)引起的腦膜炎可導(dǎo)致高死亡率和嚴(yán)重后遺癥，這對(duì)養(yǎng)豬業(yè)和公共環(huán)境衛(wèi)生管理構(gòu)成了巨大威脅[1]。然而，目前仍然沒有有效的治療方法。SS2誘導(dǎo)腦膜炎的關(guān)鍵步驟是黏附和通過血腦屏障(BBB)的侵襲，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和炎癥反應(yīng)[2]。因此，進(jìn)一步探索其發(fā)病機(jī)制將有助于對(duì)豬鏈球菌型腦膜炎進(jìn)行有效的靶向治療。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞/星形膠質(zhì)細(xì)胞(BMEC/AC)共培養(yǎng)BBB模型廣泛用于腦膜炎機(jī)制研究[3]。與單個(gè)BMEC模型相比，BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型更好地模擬了BBB的實(shí)際環(huán)境[4]。通過內(nèi)皮電阻(TEER)評(píng)價(jià)所構(gòu)建屏障模型的緊密性，高TEER值意味著單層細(xì)胞融合良好[5]。

當(dāng)SS2通過血液循環(huán)到達(dá)BBB時(shí)，它可刺激BMEC產(chǎn)生細(xì)胞因子并改變BBB的完整性，并進(jìn)一步穿過BBB侵入神經(jīng)系統(tǒng)。據(jù)報(bào)道，SS2于刺激豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PBMEC)產(chǎn)生炎癥前細(xì)胞因子。一般而言，細(xì)胞因子具有許多功能，如調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫[6]，甚至在抗菌和抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。然而，過量的細(xì)胞因子，被稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，會(huì)給機(jī)體造成更大的危害[7]。SS2感染后產(chǎn)生的細(xì)胞因子類別及其功能尚不清楚。如果可以及時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子的反應(yīng)，可以更好地選擇藥物并確定藥物治療時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。

IFN-γ是由T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的多效細(xì)胞因子，可參與許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制。最近的報(bào)道表明，IFN-γ通過激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，在某些條件下，IFN-γ的作用是有限的，甚至?xí)龠M(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。最近的一項(xiàng)研究表明，IFN-γ誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞的自噬和精氨酸耗盡，精氨酸的加入可以逆轉(zhuǎn)IFN-γ誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[8]。在SS2感染過程中，IFN-γ的表達(dá)也顯著增加。因此推測(cè)IFN-γ可在SS2感染下引起B(yǎng)MECs自噬。

在本研究中，先以豬腦切片為模型，檢測(cè)SS2感染后引起的損傷以及炎性細(xì)胞因子的變化情況，后針對(duì)炎性細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞造成的損傷進(jìn)行進(jìn)一步研究。并且成功分離了豬原代BMEC和ACs，構(gòu)建BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型，便于更好地模擬體內(nèi)BBB生理學(xué)狀態(tài)。使用ELISA和RT-PCR方法鑒定SS2感染后BBB模型細(xì)胞因子的變化。并研究在IFN-γ處理下豬腦切片，BBB模型和PBMEC的反應(yīng)，證明IFN-γ可誘導(dǎo)PBMECs自噬并破壞BBB完整性。添加精氨酸可拮抗細(xì)胞自噬和IFN-γ誘導(dǎo)的BBB損傷，為SS2腦膜炎的預(yù)防和治療提供新的見解及藥物選擇，構(gòu)建的BBB共培養(yǎng)模型也為SS2腦膜炎和BBB治療提供了有效研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料豬鏈球菌CVCC606購自中國微生物菌種保藏中心；Brain Heart Infusion(BHI)培養(yǎng)基購自海博生物；PBMEC/ACs分離自2周齡健康仔豬；DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗(青鏈霉素)購自Biological Industries；胎牛血清(FBS)購自Clark；RIPA buffer 購自碧云天；GAPDH抗體、LC3B抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG均購自Protein tech；豬重組IFN-γ蛋白購自GENWAY。

1.2 PBMEC/AC分離培養(yǎng)與BBB模型建立健康仔豬麻醉安樂致死后將頭分開并消毒。從顱骨中取出腦組織，并用無菌手術(shù)刀將其切成2 mm2厚的組織片。將組織轉(zhuǎn)移到50 mL試管中，用預(yù)冷的CM (98% DMEM/F-12+2% FBS+1% penicillin/streptomycin) 洗滌2次，重懸后以4℃、400 r/min離心5 min。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀物用等體積的25%牛血清蛋白(BSA)重懸，4℃、1 000 r/min離心15 min。離心后，收集沉淀，加入25% BSA重懸，進(jìn)一步清潔，再次離心后，細(xì)胞培養(yǎng)基重懸。培養(yǎng)60 min 后，將含有懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基移至另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)即為AC，并將先前的細(xì)胞瓶添加到新的5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中以進(jìn)行PBMEC培養(yǎng)。

共培養(yǎng)的BBB Transwell模型用分離的原代PBMEC和AC構(gòu)成。首先，將Transwell放入培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞培養(yǎng)基潤濕Transwell。將第3次傳代后的AC以2×104/cm2的細(xì)胞濃度接入Transwell，使AC黏附3 h，然后將Transwell倒置插入并置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基添加到底部腔室中，并將1.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基添加到基底外側(cè)腔室中。3 d后，將PBMEC以2×104/cm2的濃度接入Transwell的上部。每2～3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)基。共培養(yǎng)BBB模型的試驗(yàn)在兩種細(xì)胞接種后的7～8 d內(nèi)進(jìn)行。對(duì)照組包括單個(gè)PBMEC構(gòu)建的BBB模型和DMEM/F-12組(無細(xì)胞對(duì)照組)。

1.3 Real-time qPCRTRIzol(Invitrogen)裂解PBMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型或PBMECs，氯仿提取RNA (Fisher Scientific)。使用Prime ScriptTMRT Master Mix Kit (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄，SYBR Green(TaKaRa)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。用2-△△Ct法測(cè)定靶基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，基因引物列見表1。

1.4 Western blot常規(guī)方法制備樣品，電泳，將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至甲醇激活的PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入相應(yīng)二抗室溫下孵育1 h，TBST洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，Tanon成像系統(tǒng)顯影。

1.5 引物設(shè)計(jì)和合成本研究中用到的熒光定量PCR引物如表1所示，均由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.6 SS2培養(yǎng)與感染將SS2 606株在BHI中培養(yǎng)至D600= 0.6(CFU=1×108/mL)，收集1 mL菌液，離心并用PBS洗滌2次，感染腦組織切片。

2 結(jié)果

2.1 SS2感染誘導(dǎo)IFN-γ高表達(dá)為探究SS2感染后，腦組織損傷情況以及所引起的炎癥反應(yīng)，首先選用腦組織切片，檢測(cè)SS2感染后炎性細(xì)胞因子的變化情況。切取仔豬腦組織，制備腦切片培養(yǎng)，并對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，腦組織切片逐漸清晰透明，切片邊緣有明顯增生(圖1A)；并對(duì)培養(yǎng)至5 d的腦切片進(jìn)行PI染色，發(fā)現(xiàn)腦切片并無紅染(圖1B)；LDH試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦切片的LDH在1 d釋放量較高，從3 d起逐漸降低并趨于穩(wěn)定(圖1C)，以上結(jié)果表明腦切片活性良好。

表1 Real-time qPCR引物及序列

選取培養(yǎng)3 d后的切片，用SS2感染腦組織切片24 h，模擬SS2感染過程。熒光定量PCR檢測(cè)感染后炎性細(xì)胞因子表達(dá)情況。感染后的腦組織切片模型中IFN-γ、iNOS和IL-10這3種炎性細(xì)胞因子變化顯著，iNOS、IFN-γ的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯上升，而IL-10的表達(dá)量則出現(xiàn)了一定下降，ELISA結(jié)果也顯示了相似的結(jié)果(圖1D)，由此可以認(rèn)為這3種炎性細(xì)胞因子與SS2感染豬腦組織有關(guān)。

2.2 IFN-γ能誘導(dǎo)BBB通透性增強(qiáng)為了評(píng)估IFN-γ在SS2感染后對(duì)BBB的影響，檢測(cè)IFN-γ處理對(duì)BBB完整性的變化。首先分離仔豬原代BMEC和ACs，構(gòu)建了PBMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型。并在Transwell中培養(yǎng)仔豬原代BMECs和ACs，期間持續(xù)監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)BBB模型的TEER值，模型在4 d后TEER值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型的TEER值顯著高于僅由PBMECs構(gòu)建的BBB模型(圖2A)。并通過HRP滲透性檢測(cè)BBB模型的通透性(圖2B)，結(jié)果顯示BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型的基底外側(cè)HRP濃度明顯低于由PBMEC構(gòu)建的單一BBB模型(圖2B)，表明BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型的完整性更好。除此之外，還對(duì)模型中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行評(píng)估。BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平顯著高于由PBMEC構(gòu)建的單一BBB模型(圖2C)。以上結(jié)果表明，成功建立了BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型。

圖1 SS2感染對(duì)腦組織的影響 A.腦組織切片隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況；B.PI染色檢測(cè)切片活性；C.不同培養(yǎng)條件下腦切片LDH釋放情況；D.SS2感染腦切片后RT-PCR和ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子釋放情況。*.表示P<0.05；**.表示P<0.01。下同

用IFN-γ(40 μg/L)刺激成功構(gòu)建的BBB共培養(yǎng)模型，與對(duì)照組相比，24 h后BBB共培養(yǎng)模型的TEER值顯著降低(圖2D)，表明IFN-γ顯著損傷BBB共培養(yǎng)模型，IFN-γ可能破壞BBB的完整性。

2.3 IFN-γ能誘導(dǎo)PBMEC發(fā)生自噬以40 μg/L 的IFN-γ刺激腦切片，在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3的表達(dá)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，IFN-γ處理組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯升高(圖3A)，所以可以推測(cè)SS2刺激后通過IFN-γ介導(dǎo)腦組織在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了自噬。同時(shí)LDH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染后腦切片的LDH釋放量顯著升高(圖3B)。以上結(jié)果表明IFN-γ會(huì)誘導(dǎo)自噬進(jìn)而引起腦組織損傷。

通過之前的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ會(huì)破壞BBB引起腦組織中LC3Ⅱ的高表達(dá)，為判斷究竟是由哪種細(xì)胞引起的自噬，檢測(cè)IFN-γ是否會(huì)引起仔豬原代BMEC發(fā)生自噬。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入40 μg/L IFN-γ，細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量隨刺激時(shí)間的增加而升高(圖3C)。在刺激12或24 h后，Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明分離的仔豬原代BMECs可表達(dá)高水平的LC3Ⅱ(圖3D)。此外，通過RT-PCR檢測(cè)自噬信號(hào)通路中的幾個(gè)關(guān)鍵因子，包括ULK1，Becline和LC3Ⅱ，均被上調(diào)(圖3E)。該結(jié)果表明IFN-γ可誘導(dǎo)PBMEC自噬并破壞BBB的完整性。

圖2 BBB模型的建立及IFN-γ對(duì)BBB通透性的影響 A.BBB模型電阻值隨培養(yǎng)時(shí)間變化情況；B.HRP滲透量評(píng)估BBB模型完整性；C.外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)評(píng)估BBB模型完整性；D.IFN-γ引起B(yǎng)BB共培養(yǎng)模型電阻值顯著下降

圖3 IFN-γ誘導(dǎo)PBMEC發(fā)生自噬 A.IFN-γ引起腦切片中LC3高表達(dá)；B.IFN-γ引起腦切片中LDH釋放量增加；C.IFN-γ誘導(dǎo)PBMEC釋放LDH；D.IFN-γ可誘導(dǎo)PBMEC表達(dá)LC3；E.IFN-γ誘導(dǎo)自噬相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)

2.4 精氨酸可以減輕IFN-γ誘導(dǎo)的自噬并保護(hù)BBB模型的完整性據(jù)報(bào)道，精氨酸的補(bǔ)充可以緩解由IFN-γ誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞自噬，所以探究補(bǔ)充精氨酸是否可以減輕IFN-γ對(duì)PBMECs自噬的影響。與只添加IFN-γ相比，添加精氨酸(10 mmol/L)后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值顯著降低，表明補(bǔ)充精氨酸可以減輕由IFN-γ引起的PBMEC自噬(圖4A)。通過檢測(cè)電阻值以判斷添加精氨酸 (10 mmol/L)治療后對(duì)BBB完整性的影響。結(jié)果顯示，與僅添加IFN-γ組相比，添加精氨酸治療后能顯著降低IFN-γ對(duì)BBB完整性的破壞(圖4B)。

圖4 精氨酸可減輕IFN-γ對(duì)PBMEC的損傷 A.精氨酸可以減輕由IFN-γ引起的PBMEC自噬；B.補(bǔ)充精氨酸可顯著降低IFN-γ對(duì)BBB完整性的破壞

3 討論

在本研究中，利用豬腦組織切片，以及體外構(gòu)建PBMEC、AC共培養(yǎng)模型和豬原代BMEC分3個(gè)層次逐步證明在SS2感染下IFN-γ的表達(dá)會(huì)顯著增加。并通過添加IFN-γ發(fā)現(xiàn)高水平的IFN-γ可顯著破壞BMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型的完整性，這說明SS2感染后可能通過激活自噬相關(guān)因子誘導(dǎo)PBMEC自噬，進(jìn)而破壞BBB的完整性。添加精氨酸治療后，發(fā)現(xiàn)可顯著降低細(xì)胞自噬和IFN-γ誘導(dǎo)的BBB損傷，表明其可拮抗IFN-γ對(duì)豬腦部的損傷。

IFN-γ是一種具有化學(xué)活性的可溶性細(xì)胞因子，已被證實(shí)在免疫和病理反應(yīng)中起多種作用。一方面，已確定IFN-γ在各種免疫細(xì)胞的功能和成熟中起著重要作用[9]。另一方面，IFN-γ可通過激活巨噬細(xì)胞而促進(jìn)自噬體的成熟。越來越多的研究支持上皮細(xì)胞自噬的發(fā)展與IFN-γ密切相關(guān)[10]。LC3Ⅱ是哺乳動(dòng)物自噬體膜蛋白的標(biāo)志物，反映了自噬的變化[11]。本研究證實(shí)IFN-γ可促進(jìn)PBMECs自噬的發(fā)展，自噬信號(hào)通路的關(guān)鍵分子ULK1[12]和 Beclin1[13]等均顯著上調(diào)。因此，IFN-γ誘導(dǎo)PBMECs自噬的信號(hào)途徑可能有更多的相關(guān)分子參與，此過程還需進(jìn)一步研究。但本研究說明高水平的IFN-γ可以促進(jìn)SS2腦膜炎的發(fā)展。

精氨酸可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、巨噬細(xì)胞活化以及細(xì)胞因子的分泌等方式參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。在小鼠飼喂過程中添加精氨酸可通過促進(jìn)IFN-γ的分泌增強(qiáng)Th1免疫反應(yīng)，同時(shí)可增加IL-10水平調(diào)節(jié)免疫作用。本研究中，補(bǔ)充精氨酸可顯著拮抗IFN-γ對(duì)BMEC的破壞作用，抵御由IFN-γ引起的自噬對(duì)機(jī)體損傷，為精氨酸參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)提供了又一證據(jù)。

在研究中還發(fā)現(xiàn)SS2感染后iNOS的表達(dá)顯著增加。iNOS作為同工酶，可以由內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。它可以幫助巨噬細(xì)胞抵抗免疫系統(tǒng)中的病原體[14]。因此，推測(cè)iNOS可能被腦組織釋放以抵抗SS2的侵襲。IL-10在抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能中起重要作用，有助于控制和啟動(dòng)免疫反應(yīng)[15]。IL-10的過量產(chǎn)生通常會(huì)導(dǎo)致無法控制微生物的感染。本研究發(fā)現(xiàn)SS2感染后IL-10的表達(dá)顯著下降，而較低的IL-10可能有助于控制SS2感染，但該機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建原代PBMEC/AC共培養(yǎng)BBB模型，為研究BBB功能提供了很好的模型，例如鑒定可通過BBB進(jìn)入的細(xì)胞因子以及篩選BBB治療劑。此外，SS2感染產(chǎn)生的高水平IFN-γ可以通過誘導(dǎo)PBMEC的自噬而嚴(yán)重破壞BBB的完整性，而精氨酸的補(bǔ)充可以對(duì)抗這種現(xiàn)象。精氨酸與IFN-γ之間呈負(fù)相關(guān)，可以作為診斷治療SS2腦膜炎的綜合指標(biāo)，本研究為進(jìn)一步研究SS2腦膜炎奠定了良好的基礎(chǔ)。