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      金黃色葡萄球菌侵染對奶牛乳腺上皮細(xì)胞Nrf2和NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

      2020-02-24 08:21:22王建強(qiáng)馬曉敏崔璐瑩李建基
      中國獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2020年12期
      關(guān)鍵詞:侵染磷酸化炎性

      王建強(qiáng),李 俊,馬曉敏,崔璐瑩,孟 霞,李建基,王 亨*

      (1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

      奶牛乳腺炎是由各類病因引起的乳腺炎癥,其特征在于乳汁的物理、化學(xué)和細(xì)菌學(xué)變化,以及乳腺組織的病理變化,并嚴(yán)重影響著乳汁的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。奶牛乳腺內(nèi)感染通常由病原微生物引起,目前已知的能引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150種之多[2]。比較常見的有金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌、克雷伯菌、鏈球菌等,其中以金黃色葡萄球菌較為常見,且可造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,不易被清除[3]。

      核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是氧化還原反應(yīng)的主要調(diào)控途徑。Nrf2信號通路調(diào)控某些主要的抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶基因的編碼,例如谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)、硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)、血紅素加氧酶1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO-1)等[4],因此,Nrf2信號通路在細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的過程中起著重要的作用。有研究表明,熱應(yīng)激情況下奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)Nrf2及下游基因NQO-1表達(dá)升高以抵抗熱應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。另有研究表明,脂多糖(LPS)與脂磷壁酸(LTA)刺激均可引起Nrf2下游基因HO-1和GCLM的上調(diào)[5],但Nrf2信號通路是否參與了S.aureus誘導(dǎo)的BMECs損傷仍不明確。核因子κB(NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用,是免疫系統(tǒng)正常發(fā)育、特異性免疫和非特異性免疫中所必須的,也是介導(dǎo)炎癥的主要信號通路[6-7]。有研究顯示,S.aureus感染24 h上調(diào)了小鼠乳腺內(nèi)TNF-α和IL-6的表達(dá)[8],同時(shí),S.aureus感染BMECs 1 h后,NF-κB通路被顯著激活[9]。但在S.aureus感染BMECs過程中,炎性因子及NF-κB信號通路的表達(dá)是否存在差異目前仍有待研究。本試驗(yàn)旨在通過體外建立的S.aureus感染BMECs模型,觀察S.aureus侵襲過程中,Nrf2和NF-κB信號通路主要相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化,以及對炎性因子表達(dá)的影響,為探討奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 主要試劑與設(shè)備原代BMECs由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科課題組進(jìn)行原代培養(yǎng)、純化、鑒定與保存;S.aureus(ATCC 29213),購自美國典型菌種保存中心;無內(nèi)毒素胎牛血清(Gibco,美國);DMEM/F-12培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國);胰蛋白酶(Amresco,美國);兔源Nrf2抗體(Abcam,USA);兔源β-actin、p65、P-p65、IκBα、P-IκBα抗體、山羊抗兔二抗(CST,美國);Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光染料預(yù)混液、ECL發(fā)光液(諾唯贊,中國);BCA蛋白檢測試劑盒、細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天,中國);PVDF膜(Millipore,德國);蛋白電泳系統(tǒng)、PCR擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)。

      1.2 原代BMECs的分離與培養(yǎng)原代BMECs為本實(shí)驗(yàn)室通過酶消化法分離鑒定所得[10]。無菌采集健康的荷斯坦奶牛的乳腺組織,裁切成3 cm3左右立方小塊,用含有300 IU/mL青鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗后,置于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中,低溫帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理。用PBS反復(fù)清洗后,剪切成糊狀,重懸洗滌,直至上清液清亮。用0.25%的Ⅱ型膠原酶按2∶1重懸組織,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化2~3 h。依次用20和80目的篩網(wǎng)過濾消化液,1 600 r/min離心6 min,收集細(xì)胞團(tuán)塊。使用PBS重懸并清洗細(xì)胞團(tuán)塊3次后,使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞團(tuán)塊并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)瓶底面后,利用差時(shí)消化法純化BMECs。

      1.3S.aureus的培養(yǎng)將S.aureus(ATCC 29213)接種至血液瓊脂培養(yǎng)皿上,37℃培養(yǎng)10 h,挑取單個(gè)菌落接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,在37℃恒溫?fù)u床中以120 r/ min培養(yǎng)至平臺期。按1∶100轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫?fù)u床中以120 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期,根據(jù)生長曲線計(jì)數(shù)備用。

      1.4 qRT-PCR檢測炎性因子和Nrf2信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)將細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種至六孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞匯合80%后更換無血清培養(yǎng)液;S.aureus按MOI = 1∶1侵染細(xì)胞。于感染后0,0.5,1,2,3,4,6,8 h提取RNA檢測炎性因子;同時(shí)于感染后0,2,4,6,8 h提取RNA檢測Nrf2信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平。方法如下:使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,qRT-PCR檢測Nrf2信號通路關(guān)鍵基因Nrf2,Keap1和NQO-1,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表達(dá)量。引物如表1所示,每個(gè)樣本重復(fù)3次,并以β-actin為參照,按照2-△△Ct法計(jì)算出每個(gè)基因的相對表達(dá)量。

      表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

      1.5 Western blot檢測Nrf2蛋白和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平將BMECs按106個(gè)/孔接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,待細(xì)胞匯合80%以上后更換無血清培養(yǎng)液;S.aureus按MOI = 1∶1侵染細(xì)胞。于感染后0,1,2,4,6,8 h提取蛋白檢測Nrf2蛋白表達(dá)量;于感染后0,0.5,1,2,3,4,5,6 h提取蛋白檢測NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p65,P-p65,IκBα和P-IκBα表達(dá)量。方法如下:BCA法調(diào)整蛋白濃度,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)印至PVDF膜后,在5%脫脂乳內(nèi)室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜后,在二抗內(nèi)室溫孵育2 h,顯影后,通過灰度值對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

      1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。

      2 結(jié)果

      2.1S.aureus侵染對Nrf2信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響S.aureus侵染BMECs后,Nrf2基因在侵染的2,4 h表達(dá)呈極顯著上升(P<0.01),且在6,8 h 時(shí)呈極顯著下降(P<0.01)(圖1A);Keap1基因表達(dá)在侵染的2,4 h呈顯著或極顯著下降(P<0.05 或P<0.01),且在侵染的8 h呈顯著上升(P<0.05)(圖1B);NQO-1基因在侵染后2,4 h表達(dá)呈顯著或極顯著上升(P<0.05或P<0.01)(圖1C)。故,S.aureus侵染細(xì)胞2,4 h時(shí),細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號通路被激活,細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平提升;而在侵染的6,8 h時(shí),細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號通路被抑制,細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平下降。

      圖1 S.aureus侵染BMECs對Nrf2通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 A.Nrf2相對表達(dá)量;B.Keap1相對表達(dá)量;C.NQO-1相對表達(dá)量。注:與0 h相比,*表示差異顯著,P<0.05;**表示差異極顯著,P<0.01。下同

      2.2S.aureus侵染對TNF-α、IL-1β和IL-8基因表達(dá)的影響S.aureus侵染BMECs 1,2,3,4,6,8 h后,TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)(圖2);故S.aureus侵染細(xì)胞后,可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的炎性因子的合成和釋放。

      圖2 S.aureus侵染BMECs對炎性因子基因mRNA表達(dá)的影響 A.TNF-α相對表達(dá)量;B.IL-1β相對表達(dá)量;C.IL-8相對表達(dá)量

      2.3S.aureus侵染對Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響S.aureus侵染BMECs 2 h后,Nrf2蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05),而在侵染后的6,8 h,Nrf2蛋白表達(dá)量呈顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)(圖3);故Nrf2信號通路在感染后2 h時(shí)被激活,而在感染后6,8 h時(shí)被抑制。

      2.4S.aureus侵染對NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響S.aureus侵染BMECs 0.5,1,2,3,4,5,6 h后,p65磷酸化水平呈顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)(圖4);IκBα磷酸化水平在感染后1,2,3,4 h呈顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01);故S.aureus侵染BMECs后,可激活NF-κB信號通路。

      圖3 S.aureus侵染BMECs對Nrf2蛋白表達(dá)的影響 A.Western blot檢測Nrf2蛋白表達(dá)結(jié)果;B.Nrf2相對表達(dá)量

      圖4 S.aureus侵染BMECs對NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 A.Western blot檢測NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)結(jié)果;B.p65磷酸化水平;C.IκBα磷酸化水平

      3 討論

      Nrf2信號通路是細(xì)胞氧化還原的主要調(diào)控通路,在生理?xiàng)l件下,Keap1通過泛素化降解Nrf2,從而抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性[4]。而在自由基和病原的刺激下,Nrf2在DJ-1蛋白的作用下被釋放并入核,Nrf2與抗氧化元件(ARE)結(jié)合后激活下游靶基因的表達(dá)[11-12]。SUN等[13]還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)恢復(fù)后,Keap1重新入核并從ARE中釋放Nrf2,將Nrf2運(yùn)輸回胞漿中。對Nrf2基因缺失小鼠模型的研究表明,Nrf2的缺失可能會(huì)加重S.aureus引起的敗血癥和急性肺損傷,這說明了Nrf2信號通路在S.aureus感染過程中的重要性[14-15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在S.aureus感染后2 h,細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高,Nrf2、NQO-1基因顯著上調(diào),Keap1基因顯著下調(diào),表明S.aureus刺激激活了Nrf2信號通路,釋放下游解毒酶;而在感染后6,8 h時(shí),Nrf2表達(dá)受到抑制,說明此時(shí)S.aureus抑制了Nrf2信號通路的表達(dá)。JI等[16]發(fā)現(xiàn)使用LPS作用于細(xì)胞24 h后Nrf2蛋白表達(dá)量顯著降低;另有研究指出,LPS似乎對Nrf2的表達(dá)無影響[17];然而,低劑量的LPS誘導(dǎo)了Nrf2信號通路激活[18],因此,Nrf2信號通路的激活可能與LPS的劑量和作用時(shí)間有關(guān)。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果,我們推測在S.aureus感染初期,細(xì)胞通過激活Nrf2途徑上調(diào)解毒酶基因(如NQO-1)的表達(dá),而在感染后期Nrf2信號途徑可能受到抑制,表明此時(shí)抗氧化系統(tǒng)受到損傷。這也與曾慰等[19]觀察到的結(jié)果相似。

      NF-κB信號通路對免疫的主要調(diào)節(jié)作用分為經(jīng)典通路與非經(jīng)典通路。通常情況下,p65與p50構(gòu)成的NF-κB異二聚體被IκB蛋白結(jié)合,從而使NF-κB結(jié)合DNA的特性被抑制。當(dāng)宿主受到病原侵襲時(shí),病原被模式識別受體(PAMP)識別,NF-κB通路被激活,IκB蛋白在IκB激酶的作用下發(fā)生磷酸化并與p65/p50二聚體解離,該二聚體核轉(zhuǎn)位并作用于相應(yīng)的靶基因[6-7]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在S.aureus侵染BMECs后,p65與IκBα蛋白的磷酸化水平明顯上升,表明NF-κB通路被激活,p65與IκB蛋白分離并入核表達(dá)。這與吳建美等[20]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相符。

      TNF-α是一種具有多生物功能的小分子蛋白,當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí),細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性因子TNF-α與膜受體結(jié)合,促進(jìn)了IκB蛋白磷酸化,進(jìn)一步介導(dǎo)p65蛋白的入核[21]。IL-1β是炎癥發(fā)生早期的重要促炎因子,可由多種細(xì)胞分泌[22],IL-1β能夠提高細(xì)胞組織對TNF-α的敏感程度,同時(shí)刺激其他炎性因子產(chǎn)生,進(jìn)一步放大炎性作用[23]。IL-8是一類趨化因子,可特異性趨化炎癥細(xì)胞,是各種免疫細(xì)胞游走至炎癥發(fā)生部位的關(guān)鍵因子[24]。關(guān)立增等[25]發(fā)現(xiàn),S.aureus感染上調(diào)了BMECs內(nèi)IL-6和IL-8的表達(dá)。在本試驗(yàn)中,在S.aureus感染后的1~8 h,BMECs內(nèi)的TNF-α、IL-1β與IL-8的表達(dá)水平均顯著升高,從而進(jìn)一步說明細(xì)胞內(nèi)炎性的發(fā)生。WANG等[26]研究表明,S.aureus誘導(dǎo)BMECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá),同時(shí)NF-κB信號通路被激活,這與本試驗(yàn)觀察的結(jié)果相一致。

      綜上所述,S.aureus感染BMECs后,激活了Nrf2和NF-κB信號通路,促進(jìn)炎性因子的表達(dá)和釋放,說明Nrf2和NF-κB信號通路可能參與了S.aureus對BMECs的氧化和損傷過程,為探討奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制和防控提供了理論依據(jù)。

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