草莓 Metacaspase 基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

鄭益平　陳堅(jiān)　朱炳耀

摘要：【目的】精氨酸/賴(lài)氨酸特異性半胱氨酸酶（metacaspases，MCs）在植物生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，為系統(tǒng)鑒定草莓FaMC基因家族，進(jìn)行草莓FaMC基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析?！痉椒ā客ㄟ^(guò)草莓全基因組數(shù)據(jù)分析FaMC蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和保守基序，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)草莓6個(gè)組織器官和6個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期中的FaMC基兇進(jìn)行表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】蛋白序列分析表明，草莓基因組中21個(gè)FaMC成員分為3種類(lèi)型：I型、I*型和n型。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和保守結(jié)構(gòu)域分析表明：I型FaMC含N端前結(jié)構(gòu)域且包含1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu);I*型FaMC含N端前結(jié)構(gòu)域，但其中沒(méi)有鋅指結(jié)構(gòu);II型FaMC不含N端前結(jié)構(gòu)域?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aMC基因在不同組織中存在表達(dá)差異性，I型、I*型和II型FaMC基因分別在葉片、根和花中高表達(dá)。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，多數(shù)I*型FaMC基兇的表達(dá)水平呈現(xiàn)出高-低-高的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì);部分I型、II型FaMC在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式?！窘Y(jié)論】FaMC基因可能在草莓生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：草莓;metacaspase;細(xì)胞程序性死亡（PCD）;基因組;表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S668.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1188-10

0引言

【研究意義】草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，屬于八倍體（2n=8x=56）鳳梨草莓，是一種具有良好食用價(jià)值和重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的漿果類(lèi)水果[1-2]。草莓果實(shí)為聚合果（假果），由花托膨大形成，瘦果（種子）分布在其表面[3]。在草莓的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)中，維管組織發(fā)揮重要作用：韌皮部篩管白上而下運(yùn)輸葉片光合作用的有機(jī)養(yǎng)料，木質(zhì)部導(dǎo)管白下而上疏導(dǎo)根部吸收的水分和礦物質(zhì)[4-5]。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，維管組織連接瘦果和花托內(nèi)部，為瘦果和周?chē)谋”诩?xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)[6]。而篩管和導(dǎo)管的形成過(guò)程具有典型的植物發(fā)育調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡（programmedcell death，PCD）特征[7-8]。PCD是一種受基因調(diào)控的高度有序的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，可以分為環(huán)境誘導(dǎo)PCD和植物發(fā)育調(diào)控PCD兩大類(lèi)[9-10]。其中，植物發(fā)育調(diào)控的PCD則發(fā)生在植物的大部分器官和組織中，比如果實(shí)、根、莖、葉和維管組織[9，11-12]。精氨酸/賴(lài)氨酸特異性半胱氨酸酶（metacaspases，MCs）是一類(lèi)多功能蛋白，參與植物的PCD調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期和衰老等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[13-15]。根據(jù)序列相似性和保守域特征，可以把植物中的MC分為3個(gè)類(lèi)型：Type-I、Type-I*和Type-II[16]。MC蛋白包含一個(gè)類(lèi)半胱天冬酶保守結(jié)構(gòu)域（caspase-like domain， pfam00656），由p20和pl0亞基組成[13]。I型MC蛋白在p20亞基上游有一個(gè)保守的N端前結(jié)構(gòu)域，而II型MC不含N端前結(jié)構(gòu)域，但在p20和p10亞基之間的linker比I型MC長(zhǎng)[16-17]。另外，在部分I型MC蛋白的N端前結(jié)構(gòu)域中含有兩個(gè)保守的C料C鋅指結(jié)構(gòu)（LSDI-Type zinc finger moitf）[18]，而把未含鋅指結(jié)構(gòu)的歸類(lèi)為T(mén)ype-I*[16]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，越來(lái)越多植物的基因組數(shù)據(jù)得到解析，MC基因家族已經(jīng)在擬南芥[19]、水稻[20]、葡萄[21]、玉米[22]、梨[23]和森林草莓[23]等多種植物中得到鑒定與分析。例如，在森林草莓中鑒定出8個(gè)MC基因（FvMC01～FvMC08），分別為I型（FvMC01、FvMC04）、I*型（ FvMC05、FvMC07）和Il型（FvMC01、FvMC03、FvMC06和FvMC08）。在擬南芥中鑒出9個(gè)MC基因（AtMC1～AtMC9），該研究表明擬南芥AtMC基因在導(dǎo)管細(xì)胞分化和衰老過(guò)程中表現(xiàn)為典型的植物PCD差異表達(dá)。Bollhoner等的研究發(fā)現(xiàn)AtMC9調(diào)控?cái)M南芥木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞死亡中的細(xì)胞白溶[24]。AtMCl僅在葉脈中高表達(dá)[19]。在紫外線(xiàn)和過(guò)氧化氫的脅迫下，AtMC8基因表達(dá)量上調(diào)，加快了原生質(zhì)體的PCD進(jìn)程[25]。水稻OsMC基因在成熟組織中特異表達(dá)，可能參與調(diào)控葉片的衰老[20]。在葡萄胚珠發(fā)育過(guò)程中，有籽葡萄和無(wú)籽葡萄的VvMC基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。II型VvMC基因可能在葡萄成花和胚珠發(fā)育中起重要作用[21]。挪威云杉II型MC參與調(diào)節(jié)原胚團(tuán)分化為體胚后期中的PCD[26]。此外，玉米MCs介導(dǎo)的蛋白水解是葉片衰老相關(guān)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵步驟[22]。這些結(jié)果表明，MCs在不同植物生長(zhǎng)發(fā)育中的PCD起重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于八倍體草莓高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù)的發(fā)布[]開(kāi)展研究，為草莓FaMC基因家族的系統(tǒng)鑒定創(chuàng)造了條件?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)草莓FaMC基因家族全基因組的鑒定，分析了該基因家族的理化性質(zhì)、序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守基序和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)等信息，探究了該基因家族在不同組織部位以及不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究草莓MC家族基因功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2018年2～3月，于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所草莓品種保存示范基地，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的草莓紅顏（Fragaria×ananassa Duch.‘Benihope）植株作為試材，包括根、莖、葉、花（完全開(kāi)放后2d）、匍匐莖、幼果以及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)。本研究把草莓果實(shí)分為6個(gè)發(fā)育時(shí)期：即小綠期（花后8d）、大綠期（花后15d）、白果期（花后23d）、始紅期（花后26d）、片紅期（花后29d）、全紅期（花后32d），取白果期的果實(shí)作為幼果。每種材料取3次重復(fù)。樣品用液氮速凍，-80℃儲(chǔ)藏，用于后續(xù)RNA提取。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1草莓FaMC基因家族序列數(shù)據(jù)的獲得 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索MC蛋白序列，并下載擬南芥AtMC基因家族所有的蛋白序列、CDS序列及全基因序列。在草莓基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rosaceae.org/species/fhgaria/a11）中，下載Fmgaria×ananassa CamarosaGenome Assembly vl.0.a1版本的草莓基因組數(shù)據(jù)。通過(guò)本地B1astp（E<0.001），搜索草莓基因組中所有MC蛋白，篩選出候選蛋白序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對(duì)候選基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行CDD分析，剔除不符合條件的序列，確保每個(gè)草莓FaMC基因成員均含有典型caspase-like domain（Peptidase-C14）。

1.2.2草莓FaMC蛋白理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//web.expasy.org/protparam/）中的ProtParam對(duì)21條草莓FaMC蛋白質(zhì)序列的氨基酸大小、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)、親水性等基本信息進(jìn)行分析，以便分析該家族蛋白質(zhì)的共性。利用PSORTPrediction（https：//psort.hgc.jp/form.html）對(duì)草莓FaMC蛋白序列進(jìn)行在線(xiàn)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.3草莓FaMC多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過(guò)DNAMAN 6.0軟件完成對(duì)草莓FaMC氨基酸序列的多重比對(duì)。利用MAGE 7.0軟件對(duì)9條擬南芥AtMC氨基酸序列和21條草莓FaMC氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，通過(guò)鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。Bootstrap method設(shè)置為1000、Partial deletion處理缺失數(shù)據(jù)、P-distance模型，對(duì)擬南芥和草莓的MC進(jìn)行分類(lèi)。

1.2.4草莓FaMC蛋白結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Conserved Domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在線(xiàn)分析草莓FaMC蛋白保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)Multiple Em for Motif Elicitation（MEME） suite 4.12.0（http：//meme-suite.org/index.html/）在線(xiàn)分析草莓FaMC蛋白保守基序，基序的數(shù)量設(shè)置為20個(gè)。通過(guò)TBtools軟件繪制保守結(jié)構(gòu)域（CDD）和保守基序（motif）的可視化圖形。

1.2.5草莓FaMC基因家族的表達(dá)分析 對(duì)紅顏草莓的6個(gè)不同組織部位和6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)進(jìn)行總RNA提取，采用天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京）并按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用TaKaRa的Prime Script RT reagent Kit with gDNAEeaser（上海）試劑盒合成cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用生工生物工程（上海）股份有限公司在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物（表1），并由該公司合成。選用FaActin（登錄號(hào)AB116565.1）作為內(nèi)參基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器為Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCRDetection System（上海），反應(yīng)體系使用TaKaRa的SYBR Primer Ex TaqTM II試劑盒的方法，反應(yīng)程序?yàn)?4℃30s;94℃5s;60℃30s，40個(gè)循環(huán)，3次生物學(xué)重復(fù)。利用Excel對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，利用HemI1.0軟件繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1草莓FaMC基因家族序列數(shù)據(jù)的獲得

將擬南芥9條AtMC蛋白序列與草莓蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地blastp搜索，對(duì)候選蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，最終確定草莓中有21個(gè)FaMC蛋白，并從下載的草莓基因組數(shù)據(jù)中提取相應(yīng)的FaMC基因序列，將其命名為FaMC1～FaMC21。

2.2草莓FaMC蛋白理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)在線(xiàn)工具ProtParam對(duì)草莓FaMC家族蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（表2），結(jié)果顯示該家族蛋白的氨基酸數(shù)量差異較大，F(xiàn)aMC10含有的氨基酸數(shù)最少，為290個(gè)，F(xiàn)aMC7、FaMC9、FaMC15、FaMC17含有的氨基酸數(shù)量最多，均為413個(gè);該家族的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在31000～47000，其中FaMC10的相對(duì)分子質(zhì)量最小，為31963.38，最大的是FaMC15，為46277.63;其等電點(diǎn)在5.06～9.10，其中FaMC2的等電點(diǎn)最低，為5.06，最高的是FaMC14，為9.10;不穩(wěn)定系數(shù)在36～63，親水性系數(shù)皆為負(fù)值，這說(shuō)明該家族蛋白質(zhì)均為穩(wěn)定的疏水性蛋白。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，草莓FaMC蛋白主要集中在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體和細(xì)胞核（表2）。以葉綠體中分布最為廣泛，多達(dá)12個(gè)成員;其次為細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體;另外，只有FaMC5定位于細(xì)胞核。預(yù)測(cè)的草莓FaMC蛋白的亞細(xì)胞定位在不同的細(xì)胞器中，推測(cè)可能與不同成員所執(zhí)行的功能相關(guān)。

2.3草莓FaMC多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)草莓FaMC蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果，21個(gè)草莓FaMC蛋白均包含一個(gè)保守的caspase-like domain，進(jìn)一步證明這21條蛋白均屬于MC家族。如圖1所示，caspase-like domain由p20亞基、p10亞基和一段linker連接區(qū)域組成。FaMC3～FaMC6、FaMC10～FaMC16、FaMC19～FaMC21均在p20亞基上游含有一個(gè)富含脯氨酸（Pro）和谷氨酰胺（Gln）的N端前結(jié)構(gòu)域，屬于I型FaMC，其中FaMC4～FaMC5、FaMC12～FaMC14、FaMC20～FaMC21含有一個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)（LSDI-Type zinc finger）。前人把I型MC蛋白中不含鋅指結(jié)構(gòu)的歸類(lèi)為一個(gè)亞型Type I*，即FaMC3、FaMC6、FaMC10～FaMC11、FaMC15～FaMC16和FaMC19。FaMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18沒(méi)有N端前結(jié)構(gòu)域，但是在p10和p20兩個(gè)亞基之間有一個(gè)長(zhǎng)連接區(qū)（linker），屬于TypeII型。綜上所述，21個(gè)草莓FaMC成員分為三個(gè)類(lèi)型，即Type1、Typel*和TypeII。

為了進(jìn)一步探究草莓FaMC家族成員的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)MEGA 7.0軟件對(duì)擬南芥和草莓MC蛋白采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖2所示，其中I型FaMC有17個(gè)（含I*型FaMC），包括擬南芥的AtMCI～AtMC3和草莓的FaMC3～FaMC6、FaMC10～FaMC16、FaMC19～FaMC21。II型MC共有13個(gè)，包括擬南芥AtMC4～AtMC9和草莓FaMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)把I*型聚類(lèi)到I型FaMC中，草莓與擬南芥MC蛋白具有較高的同源性，推測(cè)草莓與擬南芥的直系同源蛋白之間具有相似的功能。

2.4草莓FaMC蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了進(jìn)一步研究草莓FaMC蛋白的不同功能，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域和motif的分析結(jié)果構(gòu)建MC蛋白結(jié)構(gòu)示意圖（圖3）及氨基酸保守序列表（表3）。如圖3-A、B所示，所有草莓MC蛋白具有高度保守的Peptidase-C14結(jié)構(gòu)域，也就是上文所述的caspase-like domain。I型MC中只有FaMC14的Peptidase-C14的長(zhǎng)度不足200aa，其他FaMC長(zhǎng)度差異不大，均為250--280aa，分布的位置有明顯差異。I*型中Peptidase-C14的長(zhǎng)度與I型相似。II型FaMC中的Peptidase-C14分布位置大致相同，長(zhǎng)度卻有明顯差異，F(xiàn)aMCI、FaMC8、FaMC18均為300aa，而FaMC2、FaMC7、FaMC17為155～170aa。

如圖3-C、表3所示，在草莓FaMC蛋白中共鑒定出20個(gè)個(gè)模序（motif），分別命名為motifl～motif20，長(zhǎng)度在11～50個(gè)氨基酸。利用Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這20個(gè)motif進(jìn)行注釋?zhuān)覀儼l(fā)現(xiàn)motifl～4、motif6和motif10參與編碼caspase-like domain： 在I型、I*型FaMC蛋白中的是motif1～3、motif6;而II型FaMCs蛋白中保守的是motif1～2、motif10。值得注意的是，在同類(lèi)型FaMC蛋白中，親緣關(guān)系最相近成員的motif組成和分布也高度相似，比如I型中的FaMC4、FaMC12～FaMC13、FaMC20～FaMC21以及II型中的FaMCI、FaMC8、FaMC18，推測(cè)這些蛋白的功能可能也是相似的。同時(shí)，這兩種類(lèi)型FaMC的motif組成和分布也存在一定的差異。I型FaMC特有的是motif3、motif6、motif13和motif15，而motif8、motif10～11只分布在II型FaMC中。

2.5草莓FaMC基因在不同組織的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究草莓FaMC基因家族成員的組織表達(dá)特性，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定了紅顏草莓不同組織部位中該家族基因的相對(duì)表達(dá)量，并以葉片為對(duì)照，將其相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1，分別計(jì)算出其他組織的相對(duì)表達(dá)量（圖4-A）。結(jié)果顯示，21個(gè)FaMC基因在檢測(cè)的各組織中均有表達(dá)，且在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量存在明顯差異。葉片中相對(duì)表達(dá)量較高的為FaMC4、FaMC5、FaMC11、FaMC12和FaMC20，F(xiàn)aMC6、FaMC10、FaMC14和FaMC16在根部表達(dá)量較高，莖中相對(duì)表達(dá)量較高的是FaMC6、FaMC10和FaMC14。以上均為I型和I*型FaMC基因，表明I、I*型FaMC基因主要在草莓富含維管組織的葉片、根和莖中發(fā)揮作用，與草莓的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)相關(guān)。而II型FaMC基因（FaMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18）在花和幼果中普遍有較高的表達(dá)水平，而在根、莖和匍匐莖中低表達(dá)，推測(cè)其可能與草莓生殖生長(zhǎng)或果實(shí)發(fā)育相關(guān)。

2.6草莓FaMC基因在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

為了深入了解FaMC基因在紅顏草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，對(duì)6個(gè)果實(shí)發(fā)育階段的FaMC基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。以小綠期（S1）為對(duì)照，將其相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1，分別計(jì)算出其他發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量（圖4-B）。結(jié)果顯示，F(xiàn)aMC不同成員在6個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式各異。多數(shù)I型FaMC基因（FaMC4、FaMC12、FaMC13、FaMC20和FaMC21）在果實(shí)的整個(gè)發(fā)育成熟過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量較高。其中，F(xiàn)aMC12在始紅期（S4）和全紅期（S6）表達(dá)水平上調(diào)。I*型FaMC基因（FaMC3、FaMC6、FaMC10、FaMC11、FaMC15和FaMC16）的表達(dá)水平在大綠期（S2）均略微上調(diào)，白果期（S3）后逐步下調(diào)。4個(gè)II型FaMC成員（FaMC2、FaMC7、FaMC9和FaMC17）在6個(gè)發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，而其他3個(gè)II型成員（FaMC1、FaMC8和FaMC18）在小綠期（S1）高表達(dá)，從大綠期（S2）開(kāi)始到白果期（S3）、始紅期（S4）、片紅期（S5）以及全紅期（S6）持續(xù)下調(diào)，表明這些FaMC基因可能在果實(shí)特定的發(fā)育階段起重要作用。

3討論與結(jié)論

植物MC基因是多基因家族，不同物種中MC家族成員的數(shù)量有很大差異，比如黃瓜5個(gè)CsMC基因[27]、水稻8個(gè)OsMC基因[20]、森林草莓8個(gè)FvMC基因[23]、擬南芥9個(gè)AtMC基因[19]、大麥10個(gè)HvMC基因[28]。本研究通過(guò)對(duì)八倍體草莓基因組數(shù)據(jù)的分析，鑒：定出了21個(gè)草莓FaMC成員（FaMCl～FaMC211），表明草莓的FaMC基因家族成員數(shù)量確與其他物種存在差異。Fagundes等發(fā)現(xiàn)I型MC基因的總數(shù)是II型MC基因數(shù)量的兩倍[14]，與本研究結(jié)果一致草莓I型FaMC基因（14個(gè)，包含7個(gè)I*亞型）的成員數(shù)剛好是II型FaMC基因（7個(gè)）的兩倍。而二倍體森林草莓中I型和I*型FvMC基因均為2個(gè)，II型成員數(shù)為4個(gè)。通過(guò)蛋白序列多重比對(duì)分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和motif組成分析等表明，21個(gè)草莓FaMC與擬南芥、水稻、大麥、黃瓜和葡萄等分析結(jié)果基本一致[19-21，27-28]。而對(duì)草莓和擬南芥MC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，I*型MCs沒(méi)有被很好聚類(lèi)，推測(cè)可能是由于擬南芥中缺乏I*型AtMC導(dǎo)致。

PCD是植物生命周期的重要組成部分。MC基因家族廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激調(diào)控的PCD[13-14]。前人研究表明，植物MC基因的表達(dá)存在組織差異性。擬南芥I型AtMCl僅在葉脈中高表達(dá)[19]。葡萄I型VvMC在莖中均有較高的表達(dá)水平[21]。擬南芥AtMC9在木質(zhì)部和側(cè)根冠PCD過(guò)程中表達(dá)量上調(diào)，調(diào)控木質(zhì)部導(dǎo)管PCD中的細(xì)胞自溶[24]。楊樹(shù)PttMC13和PttMC14是擬南芥AtMC9的同源基因，同樣參與調(diào)控木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞的PCD和蛋白水解[29]。本研究中多數(shù)I型FaMC基因在葉片中高表達(dá)，I*型中只有FaMC6和FaMC10在根部表達(dá)量較高，說(shuō)明這些基因可能在草莓的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。在擬南芥的花粉、胚胎維管束中觀察到AtMC2啟動(dòng)子的GUS表達(dá)增強(qiáng)[19]，五個(gè)梨PbMCs基因在花粉粒成熟和花粉管伸長(zhǎng)過(guò)程中均有轉(zhuǎn)錄活性[23]，說(shuō)明這些MC可能在生殖發(fā)育過(guò)程中起重要作用。本研究中II型FaMC基因（faMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18）主要在花和幼果中高表達(dá)，而在根、莖和匍匐莖中低表達(dá)，推測(cè)其可能與草莓生殖生長(zhǎng)相關(guān)。

器官的成熟與衰老被認(rèn)為是植物發(fā)生PCD過(guò)程的典型例子，比如果實(shí)的成熟，是一種動(dòng)態(tài)的、受?chē)?yán)格調(diào)控的發(fā)育過(guò)程，包括基因的表達(dá)[5]。在小麥穎果的維管組織韌皮部篩分子（SEs）發(fā)育過(guò)程中，TaeMCA II的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低，隨后又升高的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，暗示該蛋白可能在SEs的發(fā)育后期同樣發(fā)揮作用[30]。有趣的是多數(shù)I*型FaMCs（如FaMC3、FaMC6和FaMC16基因）在草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)出相似的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，是否這些I*型FaMC基因也與參與調(diào)控草莓果實(shí)的發(fā)育成熟有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中隨著果實(shí)的發(fā)育，個(gè)別I型和II型FaMC基因有著截然相反的表達(dá)模式，例如I型FaMC12、FaMC13在果實(shí)發(fā)育初期低表達(dá)，成熟期高表達(dá)，而II型FaMC18表達(dá)在果實(shí)發(fā)育初期的相對(duì)表達(dá)量最高，成熟期為低表達(dá)。推測(cè)I、II型FaMC基因可能在草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。Aharoni等人指出，在草莓果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中，與維管發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)是活躍的[5]。草莓FaMC基因家族是否與果實(shí)發(fā)育成熟中維管組織存在某種相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在草莓全基因組范圍內(nèi)開(kāi)展對(duì)FaMC基因家族的鑒定與分析，基于系統(tǒng)發(fā)育聚類(lèi)和序列特征把21個(gè)基因成員分為三個(gè)類(lèi)型。對(duì)全家族成員進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)和保守基序分析，得到熒光定量表達(dá)數(shù)據(jù)，為揭示FaMC基因家族在草莓營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程中的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張梅）

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收稿日期：2020-08-16初稿：2020-10-08修改稿

作者簡(jiǎn)介：鄭益平（1988-），女，碩上，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：花卉遺傳育種（E-mail： 360213443@qq.com）

*通信作者：朱炳耀（1962-），男，副研究員，研究方向：植物資源收集與利用（E-mail： 25lll2023@qq.com）

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類(lèi)專(zhuān)項(xiàng)（2018Rl019-10）