體外產(chǎn)氣法評價發(fā)酵桑葉對湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

羅陽　何芳　浣成　李昊幫　孫鏖　李劍波　李晟　易康樂

摘要：【目的】研究發(fā)酵桑葉在湖羊瘤胃中的產(chǎn)氣效果及降解率，為發(fā)酵桑葉的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā窟x用苜蓿和羊草作為試驗對照，采集3頭健康成年湖羊瘤胃液，利用體外產(chǎn)氣法評估發(fā)酵桑葉在瘤胃中48h內(nèi)的產(chǎn)氣發(fā)酵參數(shù)?！窘Y(jié)果】發(fā)酵桑葉48h體外產(chǎn)氣總量為187.25mL·g-1，與苜蓿體外產(chǎn)氣總量差異不顯著（P>0.05），但極顯著高于羊草（P<0.01）;發(fā)酵桑葉總可揮發(fā)性脂肪酸濃度為46.78mmol·L-1，極顯著高于羊草組（P<0.01）;其中發(fā)酵桑葉的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸濃度分別為29.76、10.18、4.12、1.54、0.48和0.70mmol·L-1，除丙酸外，其他酸濃度均顯著高于羊草（P<0.01）;其中丁酸和戊酸濃度顯著高于苜蓿（P<0.01）。發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草發(fā)酵液中氨態(tài)氮（NH3·N）含量分別為1.03、1.75和0.71mmol·mL-1，組間差異極顯著（P<0.01）;發(fā)酵桑葉的乙酸丙酸比值為2.2，極顯著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;發(fā)酵桑葉的干物質(zhì)降解率為46.76%，極顯著低于苜蓿和羊草（P<0.01），中性洗滌纖維降解率為70.25%，極顯著高于苜蓿和羊草（P<0.01）。【結(jié)論】發(fā)酵桑葉能促進反芻動物瘤胃產(chǎn)氣發(fā)酵，可以在反芻動物飼料中應(yīng)用推廣。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵桑葉;瘤胃發(fā)酵;湖羊;體外產(chǎn)氣法

中圖分類號：S816.6

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）11-1258-07

0引言

【研究意義】桑葉（Morus albaL.）具有抗氧化、降血脂、增強機體免疫力等生理功能[1-4]。據(jù)報道，桑葉的氨基酸組成均衡，富含黃酮類（flavonoids）、生物堿（alkaloids）、多糖（polysaccharide）等生物活性物質(zhì)[5]，飼用價值較高，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中桑葉逐漸被家畜飼料化。將桑葉制成桑葉粉是飼料工業(yè)中常用的加工技術(shù)，研究顯示桑葉粉可以提高育肥豬的日增重和提升蛋雞生產(chǎn)性能和雞蛋品質(zhì)[6-7]。由于桑葉良好的飼喂效果，使其成為一種新型的飼料資源，為緩解我國人畜爭糧、蛋白質(zhì)飼料資源短缺等問題提供新的思路和途徑?！厩叭搜芯窟M展】成熟的桑葉粗纖維含量較高，且含有植酸、單寧等抗營養(yǎng)因子，在反芻動物飼料中降低了鮮桑和桑葉粉的飼用價值[8-9]。微生物的發(fā)酵作用能有效緩解抗營養(yǎng)因子對動物消化吸收的影響，提高黃酮類化合物的利用效率，實現(xiàn)桑葉中生物活性成分的修飾和優(yōu)化[10-11]。有研究認為桑葉與反芻動物常用粗飼料存在正組合效應(yīng)，能加快瘤胃降解速度，提高瘤胃液中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的含量，促進反芻動物的生長性能[12-13]。本團隊前期的研究發(fā)現(xiàn)，添加發(fā)酵桑葉對雜交育肥牛的屠宰性能.肌肉品質(zhì)具有一定的促進作用，能提高動物機體的抗氧化和免疫能力，促進肌肉中氨基酸和脂肪酸的沉積[14-15]。【本研究切入點】但發(fā)酵桑葉對瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)酵的影響未見相關(guān)研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗以羊草和苜蓿為對照，利用體外產(chǎn)氣法評定發(fā)酵桑葉在反芻動物飼料中的利用價值，為發(fā)酵桑葉的推廣利用提供更多的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

新鮮桑葉由湖南省某桑葉種植基地提供，經(jīng)鍘草機粉碎成2cm左右的碎屑后，按照1：105質(zhì)量比添加青貯寶（主成分乳酸片球菌、植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物，購自湖南佳牛牧業(yè)有限公司）和2%的白砂糖，用網(wǎng)捆青貯裹包機進行密封，置于陰涼處自然發(fā)酵40d（環(huán)境溫度約25～30℃），發(fā)酵好的桑葉無霉變，呈黃綠色、散發(fā)酸香味。供試羊草和苜蓿由湖南省奶牛原種場提供。所有樣本經(jīng)65℃烘干后，用高速萬能粉碎機（FW135型）粉碎后過40目篩，4℃冷庫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗動物

3頭健康狀況良好且裝有永久性瘤胃瘺管的成年湖羊由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供。

1.3試驗設(shè)計

本試驗設(shè)置3個組，發(fā)酵桑葉為試驗組，標準干草苜蓿和羊草作為對照組，每組樣品5個重復(fù)，采用壓力讀取式體外產(chǎn)氣技術(shù)（RPT） [16]評估發(fā)酵桑葉對瘤胃發(fā)酵的影響，設(shè)定3個空白組不加底物用于校正。測定第2、4、6、9、12、24、36、48h產(chǎn)氣瓶內(nèi)的壓力值。

1.4發(fā)酵液配制

1.4.1發(fā)酵液原液 A、微量元素溶液：CaCl2·2H2O（分析純）13.2g、MnCl2·4H2O（分析純）10.0g、CoCl2·6H2O（分析純）1.0g、FeCl3·6H2O（分析純）8.0g、加蒸餾水定容至1000 mL;B、緩沖液：NH4HCO3（分析純）4.0g、NaHCO3（分析純）35.0g、加蒸餾水定容至1000mL;C、常量元素溶液Na2HPO4·12H2O（分析純）9.45g、KH2PO4（分析純）6.2g、MgSO4·7H20（分析純）0.6g、加蒸餾水定容至1000mL;D、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100mL蒸餾水;E、還原劑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：1mol·L-1NaOH（分析純）4.0mL;Na2S·9H2O（分析純）625mg加95mL蒸餾水。

1.4.2人工唾液配置 取蒸餾水520.3mL、緩沖液208.1mL、常量元素溶液208.1mL、微量元素溶液0.1mL、0.1%刃天青溶液1mL、還原劑溶液62.4mL共1000 mL，混勻后置于（39.0±0.5）℃恒溫水浴鍋內(nèi)，連續(xù)通入CO2，使其由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，最終為無色。

1.5測定指標和方法

1.5.1常規(guī)營養(yǎng)成分測定 飼料樣品中干物質(zhì)（DM）的測定參照國家標準（GB/T 6435-2014）、粗脂肪（EE）含量的測定參照國家標準（GBIT6438-2007）、粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱氏定氮法（GB/T 6432-2018）進行測定，中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）的含量利用VanSoest氏法測定[17]。

1.5.2體外產(chǎn)氣量測定 晨飼前采集湖羊瘤胃液于保溫杯中，混勻后經(jīng)4層紗布過濾與9倍體積的人工唾液混合[18]，得到人工瘤胃液。在120mL產(chǎn)氣瓶加入0.5g（DM）樣品，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱（M2000，美國Coylab公司）中除去氧氣，注入50mL的人工瘤胃液，取出置于（39.0±0.5）℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48h。在2、4、6、9、12、24、36、48h時利用壓力傳感器分別讀取產(chǎn)氣瓶內(nèi)的壓力值，經(jīng)空白校正后，按以下公式轉(zhuǎn)換成產(chǎn)氣體積：

GPt= Pt×（Vo-50）/（101.3×W）

式中，GPt為底物在t時間段內(nèi)的產(chǎn)氣量，mL;Pt為t時間段讀取的壓力值，kPa; Vo為產(chǎn)氣瓶體積，mL;101.3為標準大氣壓，kPa;W為底物干物質(zhì)質(zhì)量，kg;產(chǎn)氣過程的累計產(chǎn)氣量為各時間段的產(chǎn)氣量之和。

1.5.3揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）及pH值的測定 產(chǎn)氣結(jié)束后，取1mL發(fā)酵液，加入50μL85%的正磷酸，4℃條件下20000g離心10min，取上清液置于4℃冰箱中備用，用氣相色譜儀（GC-2010，日本Shimadzu公司）測定發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸的含量。利用便攜式pH計（PB-IO，德國Sartorius公司）測定發(fā)酵液的pH值。

1.5.4氨態(tài)氮（NH3·N）濃度及CH4含量測定 取5mL體外發(fā)酵培養(yǎng)液，3500g離心10min，取上清，以氯化銨為標準品，用可見分光光度計（721型）于700nm波長條件下測定NH3·N的濃度。用大劑量氣體進樣器吸取1.2mL氣體樣品，用氣相色譜儀分析氣體中CH4的含量。

1.5.5體外營養(yǎng)物質(zhì)消化率測定 體外培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)10000g離心10min，棄上清液，剩余殘渣經(jīng)65℃烘干24h后稱重，測定計算體外干物質(zhì)降解率（IVDMD）、中性洗滌纖維降解率（IVNDFD）和體外酸性洗滌纖維降解率（IVADFD）。

1.6數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步處理后，用SPSS20.0進行單因子方差分析（one-way ANOVA，LSD）和Duncan's多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵桑葉常規(guī)營養(yǎng)成分分析

由表1可知，羊草的干物質(zhì)含量最高，為93.60%，其次是苜蓿（92.45%）、發(fā)酵桑葉（90.86%），3種飼料DM含量差異極顯著（P<0.01）;發(fā)酵桑葉、苜蓿、羊草蛋白質(zhì)分別為16.67%、13.18%和5.39%，組間差異極顯著（P<0.01）;發(fā)酵桑葉粗脂肪為16.54%，極顯著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;NDF含量從高到低為發(fā)酵桑葉（69.05%）>苜蓿（54.29%）>羊草（41.34%），組間差異極顯著（P<0.01）;羊草酸性洗滌纖維含量顯著高于發(fā)酵桑葉和苜蓿（P<0.01）;苜蓿草Ca含量高于發(fā)酵桑葉和羊草，組間差異極顯著（P<0.01）;但發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草P含量無顯著性差異（P>0.05）。

2.2發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草產(chǎn)氣分析

由表2可知，48h產(chǎn)氣結(jié)束后，發(fā)酵桑葉和苜蓿累計產(chǎn)氣量為187.25、177.08mL·g-1，極顯著高于羊草（P<0.01）;產(chǎn)氣前12h，發(fā)酵桑葉的產(chǎn)氣速率最快，極顯著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;在產(chǎn)氣前6h羊草的累計產(chǎn)氣量極顯著高于苜蓿（P<0.01），6～48h苜蓿的累計產(chǎn)氣量極顯著高于羊草（P<0.01）。

2.3發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草48h發(fā)酵參數(shù)分析

由表3可知，整個產(chǎn)氣階段發(fā)酵桑葉和羊草的甲烷產(chǎn)量高于苜蓿，但差異不顯著（P>0.05）;3種飼料發(fā)酵液pH值無顯著差異（P>0.05）。發(fā)酵桑葉和苜蓿的總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）為46.78、49.80mmol·L-1，極顯著高于羊草（P<0.01）;其中發(fā)酵桑葉的乙酸產(chǎn)量為29.76mmol·L-1，與苜蓿差異不顯著（P>0.05），但顯著高于羊草（P<0.05）;發(fā)酵桑葉丙酸產(chǎn)量為10.18mmol·L-1，與羊草差異不顯著（P>0.05），但極顯著低于苜蓿（P<0.01）;異丁酸和異戊酸的產(chǎn)量由高到低依次為：苜蓿>發(fā)酵桑葉>羊草，組間差異極顯著（P<0.01）;丁酸和戊酸的產(chǎn)量由高到低依次為：發(fā)酵桑葉>苜蓿>羊草，組間差異極顯著（P<0.01）。發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草48h發(fā)酵液中氨態(tài)氮（NH3·N）含量分別為1.03、1.75和0.71mmol·mL-1，組間差異極顯著（P<0.01）;發(fā)酵桑葉的乙酸丙酸比值為2.92，極顯著高于苜蓿和羊草（P<0.01）。

2.4發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率分析

由表4可知，發(fā)酵桑葉的體外干物質(zhì)降解率為46.76%，顯著性低于苜蓿和羊草（P<0.01）;其中性洗滌纖維降解率為70.25%，極顯著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;酸性洗滌纖維降解率為34.92%，極顯著高于苜蓿，極顯著低于羊草（P<0.01）。

3討論

3.1發(fā)酵桑葉常規(guī)營養(yǎng)成分分析

桑樹已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為飼料目錄，尤其對反芻動物具有良好的適口性，成為非常規(guī)飼料開發(fā)的關(guān)注焦點。在本試驗中，發(fā)酵桑葉的CP、EE、DNF和ADF含量分別為16.67%、16.54%、69.05%和23.87%，雖然未檢測新鮮桑葉的營養(yǎng)成分，但經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，新鮮桑葉CP含量為13.61%～24.97%，EE含量為4.00%～10.00%，NDF含量為21.50%～35.66%，ADF含量為16.00%～24.13%[19-21]。除了CP和ADF外，發(fā)酵后桑葉的EE和NDF都高于鮮桑葉的含量范圍，這可能是由于微生物發(fā)酵對EE和NDF的含量產(chǎn)生了影響，胡仁建等[22-24]也發(fā)現(xiàn)青貯發(fā)酵能夠提高桑葉EE和NDF的含量。本試驗結(jié)果顯示，發(fā)酵桑葉的CP、EE和NDF含量均高于苜蓿和羊草，CP和EE分別能夠提供氮源和能量，對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境和微生物生長極為重要，而NDF對動物的干物質(zhì)采食量和飼料消化率有重要影響[25-26]。從營養(yǎng)成分數(shù)據(jù)來看，發(fā)酵桑葉適合作為反芻動物的飼料來源。

3.2發(fā)酵桑葉對瘤胃體外產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量反映飼料可發(fā)酵程度及瘤胃微生物的活性，飼料的營養(yǎng)價值越高，微生物的發(fā)酵活性越強，產(chǎn)氣量也越高[27]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵桑葉的總產(chǎn)氣量與苜蓿差異不顯著，但顯著高于羊草，而且在發(fā)酵前期產(chǎn)氣速率最快，這可能是由于發(fā)酵桑葉自身的營養(yǎng)物質(zhì)組成有關(guān)。李文娟等[28]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量高于其他牧草;Russell等[29]認為瘤胃發(fā)酵速率與非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量呈正相關(guān);張桂杰等[30]也發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物與瘤胃體外產(chǎn)氣延滯時間具有相關(guān)性。本研究數(shù)據(jù)預(yù)示瘤胃微生物能夠?qū)Πl(fā)酵桑葉的進行快速降解，利于反芻動物消化道的吸收利用。

3.3發(fā)酵桑葉對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

正常瘤胃液的pH值范圍為5.5～6.8，它反映瘤胃發(fā)酵水平和瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。試驗中發(fā)酵桑葉、苜蓿和羊草發(fā)酵液的pH值差異不顯著，且都在瘤胃的正常pH值范圍之內(nèi)，說明發(fā)酵桑葉對瘤胃酸堿內(nèi)環(huán)境未造成不良影響。甲烷的產(chǎn)生會造成瘤胃發(fā)酵能量的損失，并通過暖氣排泄造成溫室效應(yīng)。在本試驗中，發(fā)酵桑葉與苜蓿、羊草的甲烷產(chǎn)量差異不顯著，說明發(fā)酵桑葉對甲烷減排效果與苜蓿、羊草相當。VFA是飼料中碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，是反芻動物機體主要能量來源[17]。本試驗中，發(fā)酵桑葉和苜蓿的TVFA差異不顯著，但顯著高于羊草，發(fā)酵桑葉的乙酸、丙酸產(chǎn)量顯著低于苜蓿，可能是由于發(fā)酵桑葉的能量比苜蓿低[21]，與王文基等[31]的研究結(jié)果一致。NH3·N是合成微生物蛋白的重要原料，是評判瘤胃微生物蛋白質(zhì)代謝的重要指標之一[32]。本試驗結(jié)果顯示，發(fā)酵桑葉NH3·N顯著性低于苜蓿，但高于羊草，說明發(fā)酵液中的NH3·N濃度與飼料營養(yǎng)物質(zhì)含量相關(guān)，由于桑葉中富含黃酮，可能會對瘤胃NH3·N濃度產(chǎn)生影響;王夢竹等[33]認為黃酮類化合物可以顯著提高瘤胃發(fā)酵液中NH3·N的濃度，而包玲玲等[34]認為黃酮化合物能降低瘤胃中NH3·N的濃度，這有可能是本試驗發(fā)酵桑葉NH3·N濃度低于苜蓿的原因。因此，發(fā)酵桑葉對瘤胃液中NH3·N的影響還需要進一步驗證。

3.4發(fā)酵桑葉對體外降解率的影響

干物質(zhì)降解率是反映飼料在消化道降解程度的指標。本試驗中發(fā)酵桑葉的IVDMD低于羊草和苜蓿，與王雯熙等[21]的研究結(jié)果不一致，可能是與瘤胃IVDMD的測定指標差異較大有關(guān)[35]。發(fā)酵桑葉的IVNDF高于羊草和苜蓿，可能是因為桑葉NDF的含量高于苜蓿和羊草，而瘤胃對其具有同等的降解能力。

4結(jié)論

發(fā)酵桑葉營養(yǎng)成分含量高，營養(yǎng)價值與苜蓿相當，能促進瘤胃產(chǎn)氣發(fā)酵，在反芻動物飼料中有較好的應(yīng)用前景。

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（責任編輯：張梅）

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收稿日期：2020-06-17初稿：2020-09-25修改稿

作者簡介：羅陽（1988-），男，碩上，助理研究員，研究方向：反芻動物營養(yǎng)與飼料（E-mail：xinhelu509@163.com）

*通信作者：易康樂（1980-）男，博上，研究員，研究方向：動物繁殖（E-mail： 23404504@qq.com）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD050170）;湖南省科技重大專項（2017NKl020）