鐵皮石斛DoLIS基因克隆與榮莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)分析

林江波 鄒暉 王偉英 戴藝民

摘要：【目的】克隆鐵皮石斛（Dendrobium officinale）芳樟醇合酶（linalool synthase，LIS）基因，分析該基因在鐵皮石斛開花期花、葉、莖和根中的表達(dá)及茉莉酸甲酯（ Methyl Jasmonate，MejA）誘導(dǎo)表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步鑒定其功能及分析鐵皮石斛單萜類代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肦ACE-PCR和RT-PCR技術(shù)克隆DoLIS基因全長cDNA序列和開放閱讀框（open reading frame，ORF），利用ProtParam和BLAST P在線軟件進(jìn)行理化性質(zhì)分析和氨基酸同源性比對，采用MEGA 6.O構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用qPCR方法分析DoLIS基因在開花期鐵皮石斛花、葉、莖和根中的表達(dá)及MejA處理后葉片中的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】DoLIS基因cDNA序列全長2 844 bp，含有1個2 538 bp的ORF，編碼845個氨基酸。分子量為98.298 kD，理論等電點(diǎn)為7.04，不穩(wěn)定系數(shù)是46.29，屬不穩(wěn)定蛋白。DoLIS蛋白具有Terpene_cyclase_plant_CI保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，DoLIS與其他物種的（S） -（+）-LIS聚在同一支，與姬蝴蝶蘭（ XP 020576697）的LIS親緣關(guān)系最近。qPCR分析結(jié)果顯示，DoLIS基因在鐵皮石斛開花期葉片中的相對表達(dá)量最高，在MejA處理后相對表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，處理后5h相對表達(dá)量達(dá)到最高，是誘導(dǎo)前的3.88倍。【結(jié)論】本研究克隆了鐵皮石斛DoLIS基因cDNA全長，該基因在葉片中的相對表達(dá)量極顯著高于花、莖和根中的表達(dá)量。MejA處理能顯著誘導(dǎo)DoLIS基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;芳樟醇合酶;基因克隆;表達(dá)分析;茉莉酸甲酯

中圖分類號：S 567

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2020） 10-1071-07

0 引言

【研究意義】芳樟醇，又稱伽羅木醇、沉香油醇、沉香醇等，具有抗菌、鎮(zhèn)靜和殺蟲等功效[1-5]。芳樟醇是一種單鏈狀單萜醇，具有（R） -（一）一芳樟醇和（S）一（+）一芳樟醇2種對映異構(gòu)體，兩者氣味有所差異[6]。不同植物兩種對映異構(gòu)體含有比例不同，薰衣草（Lavendula angustifolia）、依蘭（Canangaodorata）、馬鞭草（Verbena officinalis）等以（R） -（一）.芳樟醇為主，鈴蘭（Convalaria majalis）、迷迭香（Rosmarinus officinalis）和甜橙（Citrus sinensis）等以（S）.（+）.芳樟醇為主[7]。芳樟醇合成酶（ linaloolsynthase，LIS）催化底物櫳牛兒焦磷酸（GPP），轉(zhuǎn)化成（R） -（一）.芳樟醇或（S）.（+）.芳樟醇[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已經(jīng)從檸檬薄荷（Menthacitrata）[9]，金桂（Osmanthus fragrans）[10]、闊葉薰衣草（Lavandula latifolia）[11]，小蒼蘭（Freesia）上[12]分離到芳樟醇合成酶基因。劉偲等[13]克隆了桂花（Osmanthus fragrans）‘蓮籽丹桂芳樟醇合酶基因OfTPS5，其表達(dá)量晝升夜降，在盛花期表達(dá)量最高。MeJA是與抗逆性相關(guān)的信號分子，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活或抑制植物次生代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的生物合成[14]。韋榮昌等[15]研究表明MejA促進(jìn)羅漢果甜苷V代謝途徑關(guān)鍵酶基因SQS和CS的表達(dá)，抑制CAS的表達(dá)。王啟等[16]等研究結(jié)果表明MejA誘導(dǎo)微型月季特定萜類合成相關(guān)基因的表達(dá)。彭亮等[17]對MejA處理后的遠(yuǎn)志幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得與三萜合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因59條，其中AACT、MK、SE和β-AS等12個基因上調(diào)表達(dá)?！颈狙芯壳腥它c(diǎn)】鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，霍昕[18]等在鐵皮石斛莖和葉揮發(fā)油中都檢測到芳樟醇，相對含量分別為1.738%和1.284%。付濤等[19]提取鐵皮石斛試管苗不同部位揮發(fā)油，結(jié)果表明，芳樟醇占莖揮發(fā)油相對含量的0.77%，葉和根的揮發(fā)油沒有芳樟醇。鄒暉等[20]提取鐵皮石斛原球莖和花的精油中都含有芳樟醇，相對含量分別為3.57%和1.21%。目前，未見鐵皮石斛芳樟醇合酶基因的相關(guān)研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本課題組根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的鐵皮石斛芳樟醇合成酶帶5'末端的cDNA序列設(shè)計3 'RACE引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆全長cDNA序列和ORF，分析芳樟醇合成酶基因在鐵皮石斛開花期不同器官中的表達(dá)及茉莉酸甲酯（ methyljasmonate，MejA）誘導(dǎo)表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步鑒定基因功能及分析鐵皮石斛單萜類代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

試驗材料為冠豸山種源鐵皮石斛，種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所資源圃。取開花期鐵皮石斛的花、葉、莖和根。用100 μ9.mL^-1茉莉酸甲酯（ MejA）噴霧鐵皮石斛葉片，取噴霧后2、5、8h的葉片。樣品用液氮速凍后，-70℃保存。

Escherichia coli DH Sa由本實驗室保存;SteadyPure植物RNA提取試劑盒和SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptrM Reverse Transcriptase和克隆載體pMD19-T購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;DiaSpin柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和San Taq PCR Mix預(yù)混液購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA提取和cDNA第1鏈合成按照SteadyPure植物RNA提取試劑盒的操作說明書提取總RNA，參照PrimeScript rM Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。取10 μL花、根、莖和葉的cDNA混合，用于全長cDNA和ORF的克隆。

1.2.2 DoLIS基因全長cDNA克隆 設(shè)計3 'RACE引物3LIS-F1、3LIS-F2和3 'adaptor引物dT-adapt、adapt（表1，下同）。以3LIS -F1和dT-adapt進(jìn)行第一輪PCR，引物3LIS -F2和adapt進(jìn)行巢式PCR，PCR程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán);72 CC延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、與pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化DH Sa感受態(tài)細(xì)胞，涂布于帶氨芐霉素（Ampicillin）抗性平板后37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽性的克隆送去測序。引物合成和測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.3 DoLIS基因ORF克隆 根據(jù)全長cDNA序列信息設(shè)計引物DoLIS-F（帶EcoRI酶切位點(diǎn)）和DoLIS-R（帶Xho I酶切位點(diǎn)），以2μL混合的cDNA為模板，用引物DoLIS-F和DoLIS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、克隆后測序。提取經(jīng)DNAMAN V6.0比對正確的陽性克隆質(zhì)粒pMD19-T-Do//S，-20℃保存。

1.2.4 DoLIS基因生物信息學(xué)分析 利用ProtParam預(yù)測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的理化性質(zhì)。通過NCBI的BLASTP在線比對，搜索氨基酸保守結(jié)構(gòu)域和同源性較高的其他物種的氨基酸序列，采用MEGA 6.0（NeighborJoining Tree， Bootstrap 1000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[21]。

1.2.5 DoLIS基因表達(dá)分析 用超微量紫外可見光分光光度計（ ND-IOOO）將鐵皮石斛各樣品cDNA第1鏈質(zhì)量濃度定量為200 ng.μL^-1。根據(jù)已經(jīng)獲得的DoLIS基因全長cDNA序列設(shè)計引物L(fēng)IS-F和LIS-R，擴(kuò)增長度為30lbp。以鐵皮石斛Actin為內(nèi)參基因，引物為DoACT-F和DoACT-R，產(chǎn)物長度為215 bp。根據(jù)SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒的說明書進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增（Roche LightCycler96）。反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2μL，SYBR GreenPro Taq HS 10 μL，上、下游引物各1μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s，61℃退火20 s，50個循環(huán)，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)性重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoLIS基因全長cDNA克隆

以鐵皮石斛混合cDNA第1鏈為模板，經(jīng)二輪的PCR擴(kuò)增，獲得1條約600 bp的清晰條帶（圖1-A），PCR產(chǎn)物經(jīng)過克隆和測序，測序結(jié)果利用DNAMAN V6.0進(jìn)行序列拼接，結(jié)果表明獲得目的基因的3 '末端，cDNA全長2 844 bp（圖2），含有一個2 538 bp的ORF，編碼845個氨基酸，5'末端非翻譯區(qū)58 bp，3 '末端非翻譯區(qū)248 bp。

2.2 DoLIS基因ORF的克隆

以混合cDNA為模板，利用引物DoLIS-F和DoLIS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1-B）顯示，在2 603 bp左右有1條亮帶，大小與預(yù)測的DoLIS基因ORF -致。PCR產(chǎn)物經(jīng)過克隆和測序，結(jié)果表明獲得了帶EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的DoLIS基因ORF。提取質(zhì)粒pMD19-T-Do//S，-20℃保存，供進(jìn)一步試驗。

2.3 DoLIS的生物信息學(xué)分析

DoLIS蛋白的分子量為98.298 kD，帶正電荷氨基酸（ Arg、Lys） 109個，帶負(fù)電荷氨基酸（Asp、Glu） 111個，理論等電點(diǎn)為7.04，不穩(wěn)定系數(shù)是46.29，屬不穩(wěn)定蛋白。

使用BLAST P在線檢索結(jié)果表明，DoLIS蛋白具有Terpene_cyclase_plant_C1保守結(jié)構(gòu)域，E值為4.85×10^-55，氨基酸序列與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsisequestris，XP一020576697）和非洲油棕（Elaeisguineensis，XP一019708546）的LIS氨基酸序列相似度分別為62%、46%。將DoLIS蛋白的氨基酸序列與其他13個物種的LIS氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）表明，LIS分為（R） -（一）-LIS和（S） -（+） -LIS兩大分支，鐵皮石斛DoLIS與（S）.（+）.LIS聚在同一支，與姬蝴蝶蘭（XP一020576697）的LIS親緣關(guān)系最近，推測其屬于（S） -（+）-LIS。

2.4 DoLIS基因在不同器官的表達(dá)

利用熒光定量PCR法檢測鐵皮石斛開花期的花、莖、葉和根中DoLIS基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示，花、莖、葉和根中都能檢測到DoLIS基因的表達(dá)，在葉片中的相對表達(dá)量最高，與花、莖和根的差異達(dá)到極顯著，花、莖和根之間相對表達(dá)量差異不顯著。

2.5茉莉酸甲酯對DoLIS基因表達(dá)的影響

利用熒光定量PCR法檢測鐵皮石斛葉片經(jīng)100μg.mL^-1MejA噴霧處理2h、5h、8h后DoLIS基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示，MejA能誘導(dǎo)鐵皮石斛DoLIS基因的表達(dá)，呈先上升后下降的趨勢。DoLIS基因在MejA處理后5h的相對表達(dá)量達(dá)到最高，是誘導(dǎo)前的3.88倍，隨后表達(dá)量開始下降，處理后8h回落到正常水平。

3 討論與結(jié)論

芳樟醇主要通過甲基赤蘚糖醇磷酸（Methylerythritol 4-phosphate，MEP）途徑合成[22]。萜烯合酶是芳樟醇等單萜類物質(zhì)合成的限速酶[23]。本研究克隆了鐵皮石斛DoLIS基因，DoLIS蛋白具有Terpene_cyclase_plant_C1保守結(jié)構(gòu)域，與其他物種的（S） -（+）-LIS聚在同一支，推測其屬于（S）.（+）.LIS。萜烯合酶功能復(fù)雜，同一種酶可以催化相同底物形成多種產(chǎn)物，也可以催化不同底物形成不同產(chǎn)物。YUE等[24]克隆了2個姜花的萜烯合酶基因HcTPS7and HcTPS8，HcTPS7催化GPP除了生成主要產(chǎn)物檜烯外，還可生成其他9種單萜副產(chǎn)物;HcTPS8催化GPP形成特異性產(chǎn)物芳樟醇，還可以催化法尼基二磷酸（FPP）合成α-香柑油烯，順式-a-紅沒藥烯，β-.金合歡烯和其他10個倍半萜。GREEN等[25]克隆了獼猴桃萜烯合酶基因AcNES1，能夠催化FPP和GPP形成倍半萜產(chǎn)物橙花叔醇和單萜產(chǎn)物芳樟醇。本研究克隆的DoLIS具有哪些催化活性還有待進(jìn)一步的研究。

LIS是單萜類化合物芳樟醇合成限速酶。//S基因在仙女扇、金桂的雌蕊、雄蕊和花瓣中都有表達(dá)，而葉片和花萼中不表達(dá)[10，26]。小蒼蘭的花瓣、雌蕊、雄蕊和葉片都能檢測到LIS基因的表達(dá)，花瓣中的表達(dá)量最高[12]。鐵皮石斛DoLIS基因在根、莖、花和葉中都能檢測到表達(dá)，葉片中的表達(dá)量最高。MeJA是植物次生代謝的重要信號分子，張文娟等[27]研究結(jié)果表明，MeJA可以上調(diào)三萜類代謝途徑關(guān)鍵酶基因HMGR、SQS和FPS的表達(dá)，相應(yīng)的總?cè)坪恳裁黠@提高，但3個基因表達(dá)模式存在差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MejA能上調(diào)DoLIS基因在鐵皮石斛葉中的表達(dá)，在100 μg.mL^-1MejA處理后Sh的相對表達(dá)量達(dá)到最高，是誘導(dǎo)前的3.88倍。MeJA上調(diào)鐵皮石斛DoLIS基因的表達(dá)是否促進(jìn)鐵皮石斛單萜類物質(zhì)芳樟醇的積累有待進(jìn)一步的分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] 姜冬梅，朱源，余江南，等.芳樟醇藥理作用及制劑研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2015，40 （18）：3530-3533.

JIANG D M，ZHU Y，YU J N，et al.Advances in research ofpharmacological effects and formulation studies of linalool[J]ChinaJournal of Chinese Materia Medica. 2015， 40（18）：3530-3533.（inChinese）

[2] 吳克剛，趙欣欣，段雪娟，等.芳樟醇?xì)庀嗫咕钚耘c作用機(jī)制[J].食品科學(xué)。2020，41 （1）：61-67.

WU K G，ZHAO X X，DUAN X J，et al.Antibacterial activity andmechaIlism of action of vapor-phase linal001[J].Food Sciemce，2020，4l（1）：61—67.（inChinese）

[3] QUEIROGA C L，DUARTE M C T，ⅪBEIRO B B，et al.LinaloolprodUCtiOn fbm thc leaVeS Of Bursera a10exylOn and itS antimiCrObialactivity[J].Fitoterpia 2007，78（4）：327—328.

[4] ALVIANO W S，MENDONCA.FILHO R R，ALVIANO D S，et al.Antimicrobial activity of Crotom cajucara Benth linalool—rich essenhaloil on artmcial biofilms and planhonic microorganisms[J].D，w，Microbiology and Immunolong，2005，20（2）：101一105.

[5] PARK S N，LIM Y K，F(xiàn)REIRE M O，et al.Amimicrobial effect of1ina100l and a-teIpine01 againSt periodOntopathiC and CariogeniCbacteria[J].Anaerobe，，2012，18（3）：369 372.

[6] BONNLANDER B，CAPPUCCIO R，LIVERANI F S，et al_Analysisof enantiomeric linal001 ratio ingreen and masted coffee[J]Flavourand Fragrance Journal，2006，21（4）：637—641.

[7] CASABIANCA H，GRAFF J，F(xiàn)AUGIER V，et al.Enantiomericdistribution SnldieS 0f lina100l and linalyl acetate.A powerful tool foraumenticity contro1 0fessemial oils[J]。Hrc-journal of High ResolutionChromatography 1998，2l（2）：107—112.

[8] CHEN X，YAUK Y，NIEUWENHUIZEN N J，et al.Characterisationof an（S）一limloo1 synmase from kiwifruit（Actinidia arguta）matCatalySeS me firSt C0mmitted Step in the prOduCtiOn Of noml lilaccompounds[J].Fumctional Plant Biology，2010，37（3）：232—243.

[9] CROWELL A L，WILLIAMS D C，DAVIS E M，et al.Molecularcloning and cbaracterization of a new linalool synthase[J].Archiveof Bio chemistry and Biophysics，2002，405（1）：112—121.

[10]唐麗，唐芳，段經(jīng)華，等，金桂芳樟醇合成酶基因的克隆與序列分析[J].林業(yè)科學(xué)，2009，45（5）：11-l9.

TANG L，TANG F，DUAN J H，et al.ClOning and SeqUenCe analySiSof a hOm01090US linalOoi SyntbaSe gene inyolyeed in floral SCentS inOsmanthus fragrans var.thunbergii[J].Scientia Silvae Sinicae，2009，45（5）：11一l9.（inChinese）

[11]趙鐘鑫，王健，李琴，等，闊葉薰衣草芳樟醇合成酶基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建[J].植物研究，2013，33（3）：308—316.

ZHAO Z X，WANG J，LI Q，et al.Cloning a hom01090us linaloolsynthase gene of Lavandula latifolia and constmction of planteXpression vector[J].Bulletin of Botanical Research，2013，33（3）：308—316.（in Chinese）

[12]樊榮輝，黃敏玲，鐘淮欽，等，小蒼蘭芳樟醇合酶基因的克隆及表達(dá)分析[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2016，38（10）：1185 1190.

FAN R H，HUANG M L，ZHONG H Q，et al.C10ning and expressionof liml001 synthase gene in Freesia [J].Chinese Journal of CellBiology，2016，38（10）：1185—1190.（inChinese）

[13]劉偲，席婉，袁金梅，等.桂花‘蓮籽丹桂芳樟醇合酶基因OfrPS5的克隆及功能鑒定[J].園藝學(xué)報，2020，47（2）：310—320.

LIU C，XI W，YUAN J M，et al.M0leCular Cloning and fLlIlctiOnalCharaCterization of linal001 SyIlthaSe gene OfrPS5 in Osmanthusfragrans 'Lianzi danguif nowers[J].Actu Horticulturae Sinica，2020，47（2）：310—320.（in Chinese）

[14]HO T，MURTHY H N，PARK S.Methyl jasmonate induced oxidativeStreSS and aCCUmUlation of SeCOndary metab01iteS in plant Cell andorgan cultures [J].International Journal of Molecular Sciences， 2020，21 （3）：716.

[15]韋榮昌，覃芳，唐美瓊，等茉莉酸甲酯對羅漢果sos. cs和CAS基因表達(dá)的影響[J].北方園藝。2019 （2）：42-47.

WEI R C，QIN F， TANG M Q， et al_Effect of methyl jasmonate onexpression of SQS. CS and CAS genes in Siraitia grosvenorii [J]Northern Horticulture. 2019（2）：42-47.（ in Chinese）

[16]王啟，劉廣達(dá)，蘇蕾.水楊酸和茉莉酸甲酯對微型月季萜類次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].分子植物育種，2020， 18 （3）：797- 803.

WANG Q，LIU G D， SU L Effects of salicylic acid and methylJasmonate on expression of terpenoid secondary metabolites relatedgenes of miniature rose [J]. Molecular Plant Breeding， 2020，18 （3）： 797803. （in Chinese）

[17]彭亮，顏永剛，陳瑩，等，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下遠(yuǎn)志幼苗轉(zhuǎn)錄組分析及三萜類生物合成途徑關(guān)鍵酶基因挖掘[J].中草藥，2020， 51（9）：2517-2529.

PENG L，YAN Y G，CHEN Y. et al.Transcriptome analysis ofPolygala tenuifolia seedlings induced by methyl jasmonate and keygenes mimng for triterpenoid biosynthetic pathway[J]. ChineseTraditional and Herbal Drugs， 2020，5 1（9）： 251 7-2529. （in Chinese）

[18]霍昕，周建華，劉文煒，等，鐵皮石斛莖、葉揮發(fā)性成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2010， 22 （B08）：43_45.

HUO X， ZHOU J H. LIU W W， et al.Determination of chemicalconstituents of the volatile oil from stem and leaf of Dendrobiumcandidum Wall. Ex Lindl EJl. Natural Product Research andDevelopment， 2010， 22 （B08）： 43-45. （in Chinese）

[19]付濤，王志龍，林立，等.GC-MS法比較鐵皮石斛試管苗不同部位中揮發(fā)油的成分[J].中成藥，2015. 37 （10）：22332238.

FU T，WANG Z L，LrN L，et al.Comparison of volatile oils indifferent parts of Dendrobium officinale tube seedlings by GC-MS [J].Chinese

Traditional Patent Medicine. 2015. 37（ 10）：2233-2238. （in Chinese）

[20]鄒暉，王偉英，戴藝民，等.GC-MS法比較分析鐵皮石斛原球莖和花的揮發(fā)性成分[J].福建農(nóng)業(yè)科技。2019 （9）：50-56.

ZOU H，WANG W Y，DAI Y M， et al.Comparative analysis ofvolatile components of Dendrobium officinale protocorm and flower by GC-MS [J].Fujian Agricultural Science and Technology， 2019（9）：5056. （in Chinese）

[21] TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6： molecularevolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology andEvolution. 2013. 30（ 12）： 2725-2729.

[22] PULIDO P，PERELLO C，RODRIGUEZ-CONCEPCION M. Newinsights into plant isoprenoid metabolism [J].Molecular Plant， 2012，5 （5）：964-967.

[23] DUDAREVA N， KLEMPIEN A，MUHLEMANN J K，et al.Biosynthesis， function and metabolic engineering of plant volatileorgame compounds [J] The New Phytologist， 2013， 198（1）：1632.

[24] YUE Y C，YU R C，F(xiàn)AN Y P.Characterization of two monoterpenesynthases involved in floral scent formation in Hedvchium coronarium[J].Planta， 2014， 240 （4）：745762

[25] GREEN S A，CHEN x Y，NIEUWENHUIZEN N J，et al.Identification， functional characterization， and regulation of theenzyme responsible for floral （E）-nerolidol biosynthesis in kiwifruit（Actinidia chinensis） [J]. Journal of Experimental BotanV， 2012.63 （5）：1951-1967.

[26] DUDAREVA N，CSEKE L，BLANC V M. et al-Evolution of floralscent in Clarkia： Novel pattems of S-Iinalool synthase gene expressionin the C. breweri flower [J] The Plant Cell， 1996，8（7）：1137-1148.

[27]張文娟，曹小迎，蔣繼宏茉莉酸甲酯誘導(dǎo)大戟三萜類代謝的研究[J].廣西植物，2015， 35 （4）：591-597.

ZHANG W J，CAO X Y，JIANG J Triterpene biosynthesis inEuphorbia pekinensis induced by methyl jasmonate [J]. Guihaia.2015. 35 （4）： 591-597. （in Chinese）

（責(zé)任編輯：林海清）

作者簡介：林江波（1976-），男，碩士，副研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)（E-mail： 345953257@qq.com）

通信作者：戴藝民（1969-），男，博士，研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)（E-mail： dymttcn@163.com）