海帶多糖L01對(duì)脂多糖作用下人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮釋放水平的影響及機(jī)制

王靳琎，魏英，錢航,黃慧敏，余飛，陳琴華,3，謝露

1 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院；3 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)是構(gòu)成血腦屏障(BBB)的重要細(xì)胞，因細(xì)胞間的緊密連接和有限的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)通量，使BBB可以阻止多種有害物質(zhì)由血液進(jìn)入腦循環(huán)，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定[1～3]。BBB的破壞是創(chuàng)傷或炎癥后的一個(gè)突出特征，其發(fā)生發(fā)展與血管滲透性改變有關(guān)[4，5]。一氧化氮(NO)是調(diào)節(jié)BBB通透性的重要介質(zhì)，參與化膿性腦膜炎相關(guān)的急性病理生理過程[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在慢性炎癥大鼠模型中，海帶多糖L01有保護(hù)外周血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，但其對(duì)腦血管內(nèi)皮炎癥損傷的抵抗少有研究。2017年8月～2018年10月，我們觀察了海帶多糖L01對(duì)脂多糖(LPS)作用下人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)NO釋放水平的影響，并通過檢測(cè)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)探討其影響的機(jī)制，旨在研究其對(duì)炎癥刺激下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系：HBMEC購(gòu)于Sciencell公司，復(fù)蘇后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，傳至3～4代。藥品與試劑:海帶多糖由本課題組自行提取，其糖含量占71.0%、硫酸根含量為83.28 mg/g；無菌生鹽水稀釋后備用；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自德國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；大腸桿菌LPS(血清型O55:B5)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；NO檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自博士德公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成。主要儀器:外排式生物安全柜(安泰空氣技術(shù)有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)耐普克公司)；超高速低溫離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 取第3代HBMEC，用10%胎牛血清培養(yǎng)液制成1×105/mL細(xì)胞懸液；以1×105/孔接種24孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞基本融合處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將其隨機(jī)分為6組?？瞻讓?duì)照組不處理，LPS組加入40 μg/mL LPS，L01對(duì)照組加入100 μg/mL L01，L01低、中、高劑量組分別加入40 μg/mL LPS+1、10、100 μg/mL L01，共同孵育48 h。

1.2.2 細(xì)胞NO檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測(cè)NO，按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 細(xì)胞eNOS、iNOS mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集各組細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中eNOS、iNOS mRNA的表達(dá)。引物序列：eNOS上游為5′-CCTGACAACCCCAAGACCTAC-3′、下游為5′-TAACATCGCCGCAGACAAAC-3′，長(zhǎng)度為112 bp；iNOS上游為5′-CGTGTTTCACCAGGAGATG-3′、下游為5′-CAGCATACAGGCAAAGAGC-3′，長(zhǎng)度為163 bp；β-actin上游為5′-ATCTGGCACCACACCTTC-3′、下游為5′-AGCCAGGTCCAGACGCA-3′，長(zhǎng)度為291 bp；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。以β-actin為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法表示eNOS、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt =(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。

1.2.4 細(xì)胞eNOS、iNOS蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，吸棄上清；PBS洗凈后，加入RIPA裂解液(1% PMSF)，置于冰上裂解至少30 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取總量為20 μg的蛋白樣品，加入樣品緩沖液，沸水浴10 min；進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉后，分別加入一抗(GAPDH、p-eNOS、t-eNOS為1∶1 000,iNOS為1∶500),4 ℃孵育過夜；用TBST洗膜后加入第二抗體(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h；用TBST洗膜后進(jìn)行ECL顯色，用BandScan軟件分析膠片灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以p-eNOS與t-eNOS比值作為p-eNOS相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組NO釋放水平比較 LPS組NO為(18.802±1.495)μmol/L，高于空白對(duì)照組的(12.506±0.609)μmol/L(P<0.01)；L01低、中、高劑量組NO分別為(14.662±0.487)、(14.144±0.334)、(14.078±0.523)μmol/L，均低于LPS組(P均<0.01)；L01對(duì)照組NO為(13.277±0.487)μmol/L，與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組eNOS、iNOS mRNA表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，LPS組eNOS mRNA表達(dá)降低而iNOS mRNA表達(dá)增加(P均<0.01)；與LPS組比較，L01中、高劑量組eNOS mRNA表達(dá)增加而高劑量組iNOS mRNA表達(dá)降低(P均<0.01)。見表1。

表1 各組eNOS、iNOS mRNA表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01。

2.3 各組eNOS、iNOS蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，LPS組eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)降低而iNOS蛋白表達(dá)增加(P均<0.01)；與LPS組比較，L01高劑量組eNOS蛋白和中、高劑量組p-eNOS蛋白表達(dá)增加，中、高劑量組iNOS蛋白表達(dá)降低(P均<0.01)。見表2。

表2 各組eNOS、iNOS蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01。

3 討論

LPS是內(nèi)毒素的主要成分，由其介導(dǎo)的病理與生理變化在慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。LPS能夠誘導(dǎo)粒細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)展[7]。

BMEC是組成BBB的主要成分，可維持腦組織內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，內(nèi)皮功能障礙是缺血性腦血管損傷發(fā)病的早期事件。在生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞維持NO的釋放，在腦血流調(diào)節(jié)和腦血管保護(hù)中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明，NO是腦血管通透性的重要調(diào)節(jié)因子[8]。此外，在細(xì)菌性腦膜炎的動(dòng)物模型以及患者中，均觀察到NO生成增加[9]。本研究采用LPS刺激HBMEC后可引起上清液NO水平增高，而加入不同劑量海帶多糖L01共孵育的細(xì)胞上清液NO水平降低，提示海帶多糖L01對(duì)NO的釋放具有調(diào)控作用。

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)型NOS和eNOS均可在成人大腦中表達(dá)；iNOS在靜息細(xì)胞中并不表達(dá)，但在LPS、細(xì)菌和促炎細(xì)胞因子刺激下而迅速被激活[10]。一經(jīng)誘導(dǎo)，iNOS合成的NO是eNOS催化所產(chǎn)生NO的100～1 000倍甚至更多，并且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。在動(dòng)物模型中，如沙門菌病、利什曼病和結(jié)核病的感染部位均發(fā)現(xiàn)iNOS表達(dá)增多[11]。在本研究中，加入LPS刺激后，可觀察到eNOS mRNA表達(dá)下降、iNOS mRNA表達(dá)上升，而海帶多糖L01可拮抗這種變化。同時(shí)，我們采用Western blotting法測(cè)定eNOS及iNOS蛋白，與空白對(duì)照組比較，LPS組eNOS蛋白表達(dá)下降、iNOS蛋白表達(dá)升高；與LPS組比較，海帶多糖L01組可升高eNOS蛋白表達(dá)、降低iNOS蛋白表達(dá)。

eNOS的活性調(diào)節(jié)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，包括了轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾。在生理刺激和病理情況下，翻譯后修飾會(huì)動(dòng)態(tài)調(diào)控酶的活性[12，13]，而最主要的翻譯后修飾過程是蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化和去磷酸化[14]。磷酸化作為一種翻譯后修飾，通過激酶向eNOS中添加一個(gè)磷酸鹽基團(tuán)，從而調(diào)節(jié)酶的活性。eNOS可以在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上磷酸化或去磷酸化，顯示了磷酸化在調(diào)節(jié)eNOS活性中的作用。不同的磷酸化位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生不同甚至相反的調(diào)節(jié)效果，目前有許多公認(rèn)的磷酸化位點(diǎn)，但最主要的磷酸化位點(diǎn)包括還原酶結(jié)構(gòu)域中絲氨酸殘基(人絲氨酸-1177、牛絲氨酸-1179)和鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的蘇氨酸殘基(人蘇氨酸-495、牛蘇氨酸-497)[15]。絲氨酸-1177(Ser1177)的磷酸化激活了eNOS活性，而蘇氨酸-495(Thr495)的磷酸化則會(huì)抑制酶活性。換而言之，Ser1177是eNOS的正性磷酸化調(diào)節(jié)位點(diǎn)，而Thr495則是eNOS的負(fù)性磷酸化調(diào)節(jié)位點(diǎn)。Heiss等[16]發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)任何刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，Ser1177位點(diǎn)處于去磷酸化狀態(tài)；當(dāng)受到刺激(如剪切應(yīng)力、雌激素等)時(shí)，該位點(diǎn)則會(huì)迅速磷酸化，使eNOS羧基末端結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而提高eNOS的活性。本研究測(cè)定的是eNOS磷酸化位點(diǎn)Ser1177的蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，LPS組Ser1177蛋白表達(dá)量下降，也進(jìn)一步驗(yàn)證了LPS組eNOS蛋白活性下降的結(jié)果；與LPS組比較，海帶多糖L01組Ser1177蛋白表達(dá)量有所升高，該結(jié)果與測(cè)定的eNOS蛋白活性相一致。

在炎癥反應(yīng)中，NO生成可能降低也可能升高，因不同細(xì)胞和不同的炎癥強(qiáng)度而不同。如以eNOS表達(dá)和活化受損為主，則NO生成減少；如以iNOS表達(dá)和活性強(qiáng)化為主，則NO生成增多。因此，NO過度產(chǎn)生既是炎癥反應(yīng)的結(jié)果，也是炎癥損害的因素。過量NO促進(jìn)組織氧自由基生成，繼而引起細(xì)胞死亡。本研究顯示，海帶多糖L01有效地逆轉(zhuǎn)了LPS對(duì)HBMEC eNOS表達(dá)和活化的抑制及對(duì)iNOS表達(dá)的促進(jìn)影響，使NO生成減少。因此，我們認(rèn)為海帶多糖L01能夠維護(hù)BBB穩(wěn)態(tài)，有利于提高腦組織抵抗炎癥損傷的能力。