可雙光子激發(fā)的聚集誘導(dǎo)發(fā)光光敏劑及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

武文博, 劉 斌

(新加坡國立大學(xué), 化學(xué)工程與分子生物工程系, 新加坡 117585)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì), 近六分之一的死亡是由癌癥造成的[1], 因此惡性腫瘤也被公認(rèn)為是人類健康的三大殺手之一. 值得注意的是, 癌癥死亡人數(shù)有一半來自亞洲. 因此, 中國“十三五”衛(wèi)生與健康規(guī)劃、 “十三五”國家基礎(chǔ)研究專項(xiàng)規(guī)劃和“十三五”衛(wèi)生與健康科技創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃都將腫瘤的治療和早期診斷作為重點(diǎn), 開發(fā)有效的癌癥診斷技術(shù)和療法是科學(xué)家們面臨的重大挑戰(zhàn). 放療、 化療及手術(shù)切除等傳統(tǒng)的癌癥療法對患者往往有較大的毒副作用或創(chuàng)傷, 而且有很強(qiáng)的局限性. 以肺癌為例, 大約80%的肺癌腫瘤無法通過手術(shù)切除治療, 而且臨床表明無法手術(shù)切除腫瘤的多數(shù)肺癌患者在傳統(tǒng)的放化療中獲益也十分有限[2]. 因此人們逐步將視線轉(zhuǎn)移到包括光動(dòng)力治療(PDT)在內(nèi)的一些新興的局部療法.

光動(dòng)力治療是通過光照激發(fā)富集在腫瘤部位的光敏劑(PS)產(chǎn)生的單線態(tài)氧(1O2)或其它活性氧(ROS)作為“藥”來破壞生物大分子, 從而實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的選擇性殺傷[3～7]. 與傳統(tǒng)療法相比, 光動(dòng)力治療的優(yōu)勢在于創(chuàng)傷小、 藥物毒性低、 選擇性好、 適用范圍廣、 無耐藥性、 副作用小及可姑息治療等[3,4]. 在臨床上, 光動(dòng)力治療已經(jīng)被用于治療口腔癌、 食管癌、 膀胱癌及直腸癌等.

光敏劑的效率是光動(dòng)力治療療效的決定性因素. 目前常用的光敏劑包括卟啉類化合物[8]、 吩噻嗪鎓類化合物[9]、 氟硼熒類化合物[10]、 花菁類化合物[11]及重金屬配合物[12]等. 這些傳統(tǒng)光敏劑的特點(diǎn)是: 雖然它們在單分子狀態(tài)下均具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射和光敏效應(yīng), 但它們的疏水性使其在水中或生理?xiàng)l件下以聚集態(tài)形式存在, 熒光發(fā)射和光敏效應(yīng)均會(huì)大幅度降低, 甚至完全猝滅[13][以苝為例, 圖1(A)], 進(jìn)而影響光動(dòng)力治療的效果. 針對聚集導(dǎo)致猝滅(ACQ)的問題, Liu等[14]和Zhang等[15]分別研制了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)的光敏劑. Tang等[16]發(fā)現(xiàn)聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng), 是指熒光生色團(tuán)在單分子狀態(tài)下微弱發(fā)光甚至不發(fā)光, 而在固態(tài)或聚集狀態(tài)下熒光顯著增強(qiáng)的一種光物理現(xiàn)象[以六苯基噻咯為例, 圖1(B)][17～19]. 研究結(jié)果表明, AIE光敏劑在聚集狀態(tài)下依然可以保持較高的熒光量子產(chǎn)率和光敏效應(yīng)[20～25]. Tang等[26]和Wang等[27]還發(fā)現(xiàn)一些特殊的AIE光敏劑, 它們在溶液狀態(tài)下完全沒有光敏能力, 而在聚集狀態(tài)下單線態(tài)氧產(chǎn)生效率非常高. 在生理?xiàng)l件下, 疏水性的光敏劑通常以聚集態(tài)形式存在, 因而這類AIE光敏劑在實(shí)際應(yīng)用中更具優(yōu)勢.

Fig.1 Fluorescent photos of solutions or suspensions of perylene(ACQ fluorophore, A) and hexaphenylsilole(AIE fluorophore, B) in THF/water mixtures with different volume fractions of water under UV lampReproduced with permission from Ref.[17], Copyright 2015, American Chemical Society.

AIE光敏劑也存在不足之處. 與傳統(tǒng)的光敏劑相比, 絕大多數(shù)AIE光敏劑的吸收和發(fā)射均處于短波長區(qū)域. 目前, 大多數(shù)AIE光敏劑的吸收峰均在300～500 nm之間, 發(fā)射峰在600～700 nm之間, 這使其在進(jìn)行光動(dòng)力治療時(shí), 穿透深度并不高[28]. 雙光子激發(fā)(TPE)是使用長波長光源激發(fā)吸收波長較短的分子的一種常用手段, 它是指以高強(qiáng)度激光(通常是飛秒脈沖激光器)照射待激發(fā)分子時(shí), 待激發(fā)分子同時(shí)吸收2個(gè)長波長光子從而到達(dá)激發(fā)態(tài)的過程[29,30]. 而雙光子光動(dòng)力治療則是一種利用雙光子激發(fā)的手段, 通過近紅外激光來激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧, 進(jìn)而殺傷癌細(xì)胞的治療方法[31,32]. 其最大的優(yōu)勢就是將激發(fā)波長紅移到了近紅外區(qū)域, 可大大提高光動(dòng)力治療時(shí)的穿透深度[33～35](圖2). 同時(shí), 由于雙光子激發(fā)需要極高的能量密度, 導(dǎo)致只有處于激光焦點(diǎn)的光敏劑可以被順利激發(fā), 因此可以大幅度提高光動(dòng)力治療時(shí)的精準(zhǔn)度[36,37](圖2). 可見, 基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力治療可以有效結(jié)合AIE光敏劑光敏性能好和雙光子激發(fā)穿透深度深、 精準(zhǔn)度高的優(yōu)勢. 因此, Liu等[38]和Chao等[39]在2017年初分別獨(dú)立開發(fā)了基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力療法. 這一新興領(lǐng)域在2年多時(shí)間內(nèi)獲得了長足的進(jìn)步. 本文將基于可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑的設(shè)計(jì)及在光動(dòng)力治療中的應(yīng)用, 討論這一領(lǐng)域最新的進(jìn)展.

Fig.2 Difference between one-photon excited and two-photon excited photodynamic therapyReproduced with permission from Ref.[35], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

1 可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑的設(shè)計(jì)

1.1 可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑的基本理論

Fig.3 Simplified Jablonski diagram depicting the electron transitions of different types of PSs upon light excitation(A) Traditional PS; (B) AIE PS in aggregated state. ISC from S1 to T1, and energy transfer from T1 to 3O2, generating cytotoxic 1O2. ISC: intersystem crossing, NR: nonradiative decay, FL: fluorescence, 1O2: singlet oxygen, 3O2: normal oxygen. Reproduced with permission from Ref.[20], Copyright 2016, Wiley-VCH.

根據(jù)文獻(xiàn)[40]報(bào)道, 單線態(tài)氧是在光動(dòng)力治療中對癌細(xì)胞殺傷效果最好的活性氧之一, 因此, 我們以單線態(tài)氧的產(chǎn)生過程為例介紹光敏劑的工作原理[圖3(A)]. 在合適波長的激發(fā)光照射下, 光敏劑從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài). 根據(jù)Kasha規(guī)則[41], 最低單重激發(fā)態(tài)(S1)是與后續(xù)的光物理過程密切相關(guān)的. 若S1態(tài)與最低三重激發(fā)態(tài)(T1)之間的能級差(ΔES-T)足夠小(通常需要小于0.3 eV)[42], 激子即可通過系間竄越(ISC)的過程, 從S1態(tài)躍遷到T1態(tài). 由于激子從T1態(tài)到基態(tài)的過程是量子力學(xué)禁阻的, 因此T1態(tài)往往具有比較長的壽命(通常為幾微秒到幾秒), 這就使得其有充足的時(shí)間與周圍的氧氣發(fā)生相互作用, 進(jìn)而將氧氣激發(fā), 形成單線態(tài)氧, 實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療. 對于傳統(tǒng)的光敏劑, 一旦形成聚集態(tài), 其分子間的π-π相互作用就會(huì)使得處于激發(fā)態(tài)的光敏劑通過非輻射躍遷(NR)而返回基態(tài), 導(dǎo)致其熒光亮度和光敏活性降低. AIE光敏劑則有所不同. 分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受限(RIM)被認(rèn)為是絕大多數(shù)AIE分子的機(jī)理[43]. 在聚集狀態(tài)下, 由于相鄰分子的空間位阻效應(yīng), 分子內(nèi)的運(yùn)動(dòng)由于具有較大的能量勢壘而受限, 從而大幅降低了非輻射躍遷, 使得同時(shí)提高其熒光亮度和光敏效率成為可能[圖3(B)]. 因此, 提高AIE光敏劑從S1態(tài)到T1態(tài)的系間竄越是提高其敏化效率的關(guān)鍵. 目前, 最廣泛使用的設(shè)計(jì)方案是通過降低分子給體與受體之間的共軛來實(shí)現(xiàn)分子最高已占分子軌道(HOMO)和最低未占分子軌道(LUMO)的分離, 進(jìn)而降低分子的ΔES-T值來提高其系間竄越[20,26,44,45].

若要實(shí)現(xiàn)基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力治療, 除了要提高AIE光敏劑的光敏效應(yīng), 其雙光子吸收截面則是另外一個(gè)需要考慮的因素. 自1961年雙光子吸收現(xiàn)象被首次報(bào)道以來[46], 經(jīng)過50余年的發(fā)展, 與雙光子吸收相關(guān)的理論和技術(shù)已經(jīng)非常成熟. 2008年, Prasad等[47]總結(jié)了一些較為通用的結(jié)論: (1) 有機(jī)分子的共軛越好, 有效共軛長度越長, 其雙光子吸收截面越高; (2) 在一定強(qiáng)度的范圍內(nèi), 給體-受體越強(qiáng), 其雙光子吸收截面越高; (3) 分子的平面性越好, 對稱性越高, 雙光子吸收性能也會(huì)越好; (4) 由于協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng), 枝狀結(jié)構(gòu)有利于提高雙光子吸收截面. 可見, 這與AIE光敏劑的設(shè)計(jì)理念存在一些沖突. AIE光敏劑的設(shè)計(jì)需要降低分子給體-受體之間的共軛, 而提高雙光子吸收截面則需要改善其共軛; AIE光敏劑需要分子出現(xiàn)一定的扭曲, 而提高雙光子吸收則需要分子盡可能保持平面. 因此, 盡管在理論上基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力治療具有諸多優(yōu)勢, 但也直到近幾年才出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道. 為了避免這些矛盾, 科學(xué)家們做了許多探索和嘗試, 以期設(shè)計(jì)并制備光敏效應(yīng)和雙光子吸收截面兼?zhèn)涞腁IE光敏劑.

1.2 通過給體-受體精準(zhǔn)調(diào)控設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑

Fig.4 Design and properties of TPEDC(A) Chemical structure, HOMO and LUMO distributions of TPEDC; (B) UV-Vis spectra of ABDA in the presence of TPEDC NPs under light irradiation(60 mW/cm2, 400—700 nm) in water; (C) two-photon absorption cross section of TPEDC NPs at different wavelengths, the inset shows the two-photon-induced fluorescence spectrum; (D, E) detection of intracellular ROS generation using DCF-DA in HeLa cells incubated with(E) and without(D, control) TPEDC NPs followed by different two-photon scans, λex=488 nm; λem=505—525 nm. Fig.(A) was reproduced with permission from Ref.[45], Copyright 2017, Wiley-VCH; Figures(B—E) were reproduced with permission from Ref.[38], Copyright 2017, Wiley-VCH.

給體和受體的結(jié)構(gòu)及二者之間的共軛是實(shí)現(xiàn)光敏效應(yīng)和雙光子吸收截面的關(guān)鍵. 光敏效應(yīng)需要適當(dāng)降低二者之間的共軛以實(shí)現(xiàn)HOMO-LUMO的更好分離, 而提高雙光子吸收截面則需要更好的共軛. 因此, 如果能對給體、 受體及共軛橋進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控, 理論上能夠制備雙光子激發(fā)的AIE光敏劑, 這也是我們最初的設(shè)計(jì)理念. 我們[38]首先選取了具有AIE性質(zhì)的含雙甲氧基取代的四苯乙烯作為給體單元, 確保所得到光敏劑具有AIE效應(yīng). 對受體單元和共軛橋進(jìn)行篩選, 發(fā)現(xiàn)以丙二腈為受體單元, 苯環(huán)為共軛橋時(shí), 得到的TPEDC[圖4(A)] 可滿足雙光子光動(dòng)力的所有要求. 由圖4(A)可見, TPEDC的HOMO和LUMO幾乎沒有重疊, ΔES-T僅為0.23 eV. 因此, 使用兩親性聚合物包覆TPEDC所形成的納米顆粒(NPs)在水中具有非常良好的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率. 9,10-蒽二基-雙(亞甲基)二甲酸(ABDA)是一個(gè)常用的單線態(tài)氧指示劑. 通過其吸收變化[圖4(B)]可以計(jì)算出, 在白光照射下(60 mW/cm2, 400～700 nm), TPEDC消耗ABDA的速率為5.5 min-1, 其效率遠(yuǎn)高于常用的卟啉類光敏劑Ce6. 同時(shí), 該納米顆粒具有良好的雙光子吸收性能, 其在850 nm處的雙光子吸收截面可達(dá)3500 GM[圖4(C)](基于納米顆粒的測試結(jié)果會(huì)遠(yuǎn)大于基于分子的測試結(jié)果, 因此二者不具備可比性, 應(yīng)考慮測試條件). 我們在細(xì)胞中驗(yàn)證了TPEDC納米顆粒在雙光子激發(fā)下產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力. 二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)在細(xì)胞中被酯酶水解, 隨后遇到活性氧即可發(fā)射出明亮的綠光, 因此可作為活性氧的指示劑使用. 在用雙光子激發(fā)經(jīng)TPEDC納米顆粒和DCF-DA處理過的海拉細(xì)胞后, 可以在激光共聚焦顯微鏡下看到明亮的綠光[圖4(D, E)], 證明TPEDC在雙光子激發(fā)下的高效光敏活性.

Tang等[48,49]對這種設(shè)計(jì)方法進(jìn)行了改進(jìn). 與四苯乙烯類似, 三苯胺也是一個(gè)富電子的芳基單元, 同樣可以作為電子給體來設(shè)計(jì)光敏劑. 同時(shí), 三苯胺也被證實(shí)是一個(gè)具有較大雙光子吸收截面的結(jié)構(gòu)單元[49～51]. 最近的研究表明, 將三苯胺與合適的受體單元以單鍵鏈接后, 產(chǎn)物高概率會(huì)表現(xiàn)出AIE特性[48,49]. 因此, 用三苯胺單元作為給體替換AIE光敏劑中的四苯乙烯單元, 有望在保持其AIE特性的基礎(chǔ)上同時(shí)提高其光敏性能和雙光子吸收截面. 基于此, Tang等[35]設(shè)計(jì)了AIE光敏劑IQ-TPA[圖5(A)], 以二氯熒光素(DCFH)為指示劑的活性氧測試結(jié)果表明, 將給體替換為三苯胺后, IQ-TPA在單光子激發(fā)下的光敏能力較TPE-IQ-2O有了明顯提升[圖5(B)]. 同時(shí), 三苯胺單元的引入, 使IQ-TPA具有良好的雙光子吸收, 其分子雙光子吸收截面在900 nm處達(dá)到最大, 為215 GM[圖5(C)].

Fig.5 Design and properties of IQ-TPA(A) Chemical structures of TPE-IQ-2O and IQ-TPA; (B) change in fluorescence intensity at 525 nm of TPE-IQ-2O/IQ-TPA and DCFH in PBS upon white light irradiation for different times; (C) two-photon absorption spectrum of IQ-TPA.Reproduced with permission from Ref.[35], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

隨后, Tang等[52]利用這種設(shè)計(jì)理念, 設(shè)計(jì)了另一個(gè)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑DCDPP-2TPA[圖6(A)]. DCDPP-2TPA以二腈基吡嗪受體為核, 2個(gè)三苯胺給體單元為枝, 苯環(huán)為共軛橋, 形成V型的D-π-A-π-D結(jié)構(gòu). 這些結(jié)構(gòu)特征均符合有機(jī)分子雙光子吸收截面的要求. 因此, 根據(jù)圖6(A)制備含DCDPP-2TPA的納米顆粒以增強(qiáng)其水溶性后, DCDPP-2TPA納米顆粒在水溶液中表現(xiàn)出非常好的雙光子吸收性能, 其在1040 nm處的雙光子吸收截面達(dá)到了3.28×106GM, 遠(yuǎn)高于前述其它AIE光敏劑, 但該分子的光敏性能一般. 經(jīng)450 nm藍(lán)色激光照射25 min后, 16 ng光敏劑納米顆粒僅能消耗約20 ng ABDA. 因此, 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中, 雖然DCDPP-2TPA 納米顆粒經(jīng)雙光子激發(fā)可以產(chǎn)生活性氧[圖6(B)], 但效率并不高. 這也證明了同時(shí)提高AIE光敏劑的光敏效應(yīng)和雙光子吸收截面是比較困難的.

Fig.6 Design and properties of DCDPP nanoparticles (A) Preparation of DCDPP-2TPA-encapsulated silica nanoparticles; (B) two-photon fluorescence imaging of HeLa cells after irradiation for 5 min with a 1040 nm fs laser pretreated with DCDPP-2TPA-encapsulated silica NPs(0.018 mg/mL) and DCF-DA(25 μmol/L), or only DCF-DA(25 μmol/L).Reproduced with permission from Ref.[52], Copyright 2018, Wiley-VCH.

1.3 通過重金屬配合物設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑

最近, Chao等[39,53]提出了設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑的另一個(gè)思路. Chao等[54,55]發(fā)現(xiàn)以咪唑作為配體的銥配合物具有較好的雙光子吸收性質(zhì). 而重金屬配合物往往或多或少都具備一些光敏性能[12], 在此基礎(chǔ)上, 將苯環(huán)通過單鍵引入這類銥配合物中以提供“轉(zhuǎn)子”來賦予其AIE特性, Chao等[53]制備了可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑Ir1和Ir2 [圖7(A)]. 隨后, Chao等[39]將具有AIE性能的雙光子吸收基團(tuán)三苯胺以單鍵鏈接到配體上, 制備了Ir3, Ir4和Ir5, 進(jìn)一步提高了其雙光子吸收截面. 其中, Ir3的性能最優(yōu), 處于分子狀態(tài)時(shí), 其在730 nm處的雙光子吸收截面達(dá)到了214 GM, 而且無論熒光亮度還是單線態(tài)氧產(chǎn)生效率在聚集狀態(tài)下均有大幅提升[圖7(B～D)]. 目前, 對可雙光子激發(fā)的金屬配合物AIE光敏劑的研究還僅限于上述工作, 其中最主要的原因就是金屬配合物的潛在毒性問題. 以Ir3為例, 在不加任何光源的前提下, 其對海拉細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為(38.6±1.7) μmol/L, 只比順鉑(28.8±2.3)略高[39], 導(dǎo)致以這些金屬配合物為光敏劑進(jìn)行光動(dòng)力治療時(shí), 存在很強(qiáng)的毒副作用. 但這種設(shè)計(jì)思路為后續(xù)設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑提供了有益借鑒.

Fig.7 Design and properties of Ir1—Ir5(A) Chemical structures of Ir1—Ir5; (B) Trajectory of Ir3 emission intensity versus water fraction and visual observation of PL; (C) TPA cross-sections of Ir3; (D) 1O2 emission spectra in the presence of Ir3 and irradiation(405 nm laser) in varying fractions of water-DMSO mixture.Reproduced with permission from Ref.[38], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

1.4 通過“聚合增強(qiáng)雙光子光敏”概念設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑

研究表明, 制備可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑需要非常精確的分子設(shè)計(jì). 目前主要還是通過HOMO-LUMO分離來提高AIE分子的光敏效應(yīng), 而這在某種程度上并不利于提高其雙光子吸收. 因此, 尋找提高光敏效應(yīng)的其它方法就顯得十分必要. 2018年, Liu等[56,57]提出了“聚合增強(qiáng)光敏(Polymerization-enhanced photosensitization)”的概念. 與相似的小分子光敏劑相比, 共軛聚合物(CP)在光照下往往會(huì)具有更高的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力. 其原因在于, 隨著聚合度的提高, 光敏劑的激發(fā)態(tài)之間的能級差逐漸接近, 使得單重激發(fā)態(tài)至三重激發(fā)態(tài)的系間竄越有了更多可行的途徑, 進(jìn)而提高其單線態(tài)氧產(chǎn)生效率. 同年, Tang等[58]也報(bào)道了類似現(xiàn)象. 共軛聚合物最大的特征就是其π共軛骨架, 而較大的共軛結(jié)構(gòu)對雙光子吸收十分有利[47,59]. 基于此, Liu等[60]設(shè)計(jì)并合成了與TPEDC結(jié)構(gòu)類似的共軛聚合物PTPEDC1, 隨后又改變了其共軛鏈接方式制備了PTPEDC2, 以進(jìn)一步提高其共軛程度[圖8(A)]. 將這些光敏劑用兩親性聚合物包覆后, 可制備具有良好水分散性的納米顆粒. 在基本不影響吸收與發(fā)射的前提下[圖8(B)], 共軛聚合物PTPEDC1納米顆粒的光敏性能提高至小分子光敏劑TPEDC納米顆粒的2.27倍[圖8(C)], 而其雙光子吸收截面提高到了TPEDC納米顆粒的3.15倍[圖8(D)]. 當(dāng)其共軛程度進(jìn)一步改善后, PTPEDC2納米顆粒的光敏性能和雙光子吸收截面分別提高至TPEDC納米顆粒的5.48倍和6.15倍. 通過圖9(A)所示的裝置, 以二氯熒光素為指示劑, 直接測試了這些AIE光敏劑納米顆粒在雙光子激發(fā)下的光敏性質(zhì)[圖9(B)][60]. 由圖9(B)可以看出, 在相同條件下, PTPEDC2表現(xiàn)出比小分子光敏劑TPEDC及臨床上常用的光敏劑Ce6強(qiáng)得多的雙光子光敏性能. 這種設(shè)計(jì)理念被命名為“聚合增強(qiáng)雙光子光敏”(polymerization-enhanced two-photon photosensitization)[60], 為后續(xù)設(shè)計(jì)新型可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑提供了一種全新的思路.

Fig.8 Design and properties of PTPEDC2(A) Chemical structures of TPEDC, PTPEDC1 and PTPEDC2; (B) normalized absorption and photoluminescence(PL) spectra of AIE PS NPs in aqueous media; (C) normalized degradation percentages of ABDA in the presence of PS NPs in aqueous media upon white light irradiation(400—700 nm, 50 mW/cm2); [AIE PS NPs]=10 μmol/L based on AIE PS; [ABDA]=50 μmol/L; (D) two-photon absorption cross-section spectra of AIE PS NPs in aqueous solution.Reproduced with permission from Ref.[60], Copyright 2019, American Chemical Society.

Fig.9 Schematic illustration for the in vitro ROS detection of AIE PS NPs in aqueous media under two-photon excitation(A) and in vitro real-time detection of ROS generation in aqueous solution of PS NPs under two-photon excitation after different scans(B)The image in the last column is the overlay image between the 1th and 5th columns. λex=820 nm, λem: 635—675 nm(red, from PS NPs) and 510—535 nm(green, from DCFH), scanning laser: 820 nm, 6 mW, 5.33 s per scan. Reproduced with permission from Ref.[60], Copyright 2019, American Chemical Society.

2 可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

2.1 雙光子光動(dòng)力細(xì)胞消融

光敏劑在生物醫(yī)學(xué)中最大的應(yīng)用就是光動(dòng)力治療, 這也是最初設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑的目的. 在可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑誕生之初, Liu等[37]以TPEDC為光敏劑, 驗(yàn)證了其在癌細(xì)胞的雙光子光動(dòng)力殺傷中的應(yīng)用. 活/死細(xì)胞染色試劑盒經(jīng)常被用于表征藥物對細(xì)胞的殺傷情況. 其中, 鈣黃素(Calcein)是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的優(yōu)良染色試劑, 當(dāng)其存在于活細(xì)胞內(nèi)時(shí), 可在細(xì)胞內(nèi)無所不在的脂酶作用下, 發(fā)射出明亮的綠色熒光. 而碘化丙啶(Propidium iodide)可以進(jìn)入受損的細(xì)胞, 與核酸結(jié)合, 產(chǎn)生明亮的紅色熒光信號. 由圖10(A)可見, 在TPEDC存在的前提下, 隨著雙光子掃描次數(shù)的增多, 代表活細(xì)胞的綠色熒光逐漸減少, 而代表死細(xì)胞的紅色熒光逐漸增多, 證明了基于TPEDC的雙光子光動(dòng)力對癌細(xì)胞的殺傷十分有效. 定量數(shù)據(jù)表明, 當(dāng)TPEDC的濃度為10 μg/mL, 激光功率為20 mW時(shí), 通過20次掃描即可殺死50%的海拉細(xì)胞. 另外, 由于雙光子吸收對激發(fā)光能量要求較高, 因此雙光子光動(dòng)力現(xiàn)象只能在激發(fā)光的焦點(diǎn)上觀察到, 即圖10(A)中的白框區(qū)域. 而對于單光子光動(dòng)力, 光敏劑將會(huì)對所有經(jīng)光照射處產(chǎn)生破壞[圖10(B)][61], 表明雙光子光動(dòng)力治療具有比單光子光動(dòng)力治療高得多的精準(zhǔn)度.

光動(dòng)力治療時(shí), 將光敏劑靶向至細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞器可以改進(jìn)療效, 其原因在于單線態(tài)氧的壽命很短(在水中的半衰期僅為3.1 μs), 在生理?xiàng)l件下作用距離十分有限[62], 因此將光敏劑靶向至關(guān)鍵細(xì)胞器后可顯著提高其產(chǎn)生的單線態(tài)氧對細(xì)胞器的破壞力. 線粒體負(fù)責(zé)為整個(gè)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)提供能量, 而基于具有線粒體靶向功能的光敏劑的光動(dòng)力治療也被證實(shí)是最有效殺傷細(xì)胞的光動(dòng)力策略之一. 大多數(shù)癌細(xì)胞具有更高的線粒體膜電位, 因此許多陽離子化合物均可以在癌細(xì)胞的線粒體中富集[63]. IQ-TPA和銥配合物(Ir1～I(xiàn)r5)均帶有正電荷, 可以實(shí)現(xiàn)線粒體靶向. 因此, 這些光敏劑也被利用來實(shí)現(xiàn)線粒體靶向的癌細(xì)胞雙光子光動(dòng)力殺傷[35,39,53]. 由于IQ-TPA本身在雙光子激發(fā)時(shí)能發(fā)射橙紅色的熒光(發(fā)射峰為622 nm), 因此可以在進(jìn)行雙光子光動(dòng)力的同時(shí), 利用其雙光子熒光對癌細(xì)胞線粒體進(jìn)行成像, 通過監(jiān)測線粒體的變化以監(jiān)控整個(gè)雙光子光動(dòng)力過程[35]. 由圖11可見, 隨著雙光子掃描次數(shù)的增加, 本來是網(wǎng)狀的線粒體結(jié)構(gòu)逐漸碎成了顆粒狀, 證明了雙光子光動(dòng)力對線粒體的破壞. 定量結(jié)果也證明IQ-TPA在雙光子激發(fā)下對癌細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷: 當(dāng)IQ-TPA的濃度為1 μmol/L, 激光功率為20 mW時(shí), 14次掃描即可殺死50%的海拉細(xì)胞, 明顯優(yōu)于TPEDC納米顆粒的結(jié)果.

Fig.11 Monitoring the mitochondrial change during two-photon PDT by the fluorescence of IQ-TPAFluorescence images of HeLa cells were incubated with 1 mmol/L of IQ-TPA for 30 min and then followed by two-photon scans: (A, A′) 1 scan, (B, B′) 33 scans, (C, C′) 66 scans, (D, D′) 100 scans. The two-photon excitation condition was at 900 nm(fs Ti: sapphire laser, 5 mW) with a scan area of 60 mm×60 mm and a scan speed of 1.02 s per scan.Reproduced with permission from Ref.[35], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

Fig.12 Chemical structures of TPE-red and PSMA as well as the preparation of AIE-PSMA NPs(A) and transmission images of HeLa cells with different treatment(B)Reproduced with permission from Ref.[65], Copyright 2017, Royal Society of Chemistry.

光子在近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ, 1000～1700 nm)表現(xiàn)出比在可見光區(qū)域和近紅外一區(qū)(NIR-Ⅰ, 700～900 nm)更高的穿透能力及更低的組織吸收和散射[64]. 因此, 利用近紅外二區(qū)的激光來激發(fā)AIE光敏劑進(jìn)行雙光子光動(dòng)力理論上也更有優(yōu)勢. Qian等[65]選取2014年由Zhang等[15]開發(fā)的AIE光敏劑TPE-red[圖12(A)], 證實(shí)了其在近紅外二區(qū)具有一定的雙光子吸收性質(zhì), 并測試了其在1040 nm 處的雙光子吸收截面為27.7 GM. 將TPE-red以兩親性的PSMA包覆后, 可以制備成具有良好水分散性的納米顆粒AIE-PSMA. Qian等以海拉乳腺癌細(xì)胞為模型驗(yàn)證了AIE-PSMA在1040 nm飛秒激光激發(fā)下的雙光子光動(dòng)力效果. 隨著激光照射時(shí)間的延長, AIE-PSMA使海拉細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯變化(變圓), 甚至壞死. 而在不含光敏劑或不進(jìn)行雙光子激發(fā)的對照組, 其細(xì)胞的形貌基本沒有變化[圖12(B)]. 半定量結(jié)果表明, 在光敏劑AIE-PSMA納米顆粒的濃度為20 μg/mL的前提下, 1040 nm飛秒激光(60 mW)照射2 min可以殺傷大約90%的海拉細(xì)胞.

2.2 雙光子光動(dòng)力腫瘤治療

2019年, Liu等[60]首次將基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力應(yīng)用于治療活體內(nèi)的實(shí)體瘤. 使用米非司酮和苯基硫脲喂養(yǎng)斑馬魚幼苗, 以誘發(fā)斑馬魚的肝臟產(chǎn)生癌變, 建立斑馬魚幼苗的肝癌模型, 并基于“聚合增強(qiáng)雙光子光敏”概念設(shè)計(jì)的PTPEDC2納米顆粒為光敏劑來研究雙光子光動(dòng)力的療效[圖13(A)]. 將光敏劑PTPEDC2納米顆粒通過靜脈注射進(jìn)斑馬魚幼苗后, 對PTPEDC2進(jìn)行雙光子成像, 觀察到PTPEDC2納米顆?？赏ㄟ^實(shí)體瘤的高通透和滯留(EPR)效應(yīng)在腫瘤部位富集, 且其在腫瘤部位的濃度在注射24 h后達(dá)到最高. 此時(shí), 使用820 nm激光掃描腫瘤部位, 通過雙光子技術(shù)激發(fā)光敏劑, 并監(jiān)測腫瘤尺寸的改變[圖13(B)]. 雙光子光動(dòng)力治療24 h后, 腫瘤尺寸降低了大約20%, 而在其它3組對照組中, 腫瘤的尺寸均增長了約50%, 證實(shí)了基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力抗腫瘤治療在活體上也十分有效.

Fig.13 Two-photon excited PDT results of in PTPEDC2 NPs in zebrafish liver tumor model (A) Schematic illustration of in vivo two-photon excited PDT of PTPEDC2 NPs in zebrafish liver tumor model; (B) the relative increase(in percent) in zebrafish tumor size after different treatments. N.S.: data are not significantly different; double asterisks indicate p<0.01, and n=6. Laser: 820 nm fs laser.Reproduced with permission from Ref.[60], Copyright 2019, American Chemical Society.

2.3 雙光子光動(dòng)力血管閉合

雙光子光動(dòng)力在活體應(yīng)用的另一個(gè)模型就是光控血管閉合. 光動(dòng)力誘發(fā)的血管閉合可導(dǎo)致閉合血管附近的腫瘤壞死, 從而達(dá)到治療腫瘤的目的[66]. 當(dāng)病灶部位在腦部及眼部等相對復(fù)雜的部位時(shí), 具有高精準(zhǔn)度的雙光子激發(fā)手段對光控血管閉合就顯得尤為重要[67]. Liu等[38]利用AIE光敏劑實(shí)現(xiàn)了小鼠腦部血管的雙光子成像和雙光子光動(dòng)力血管閉合. 首先通過顯微外科手術(shù)打開了小鼠的頭骨, 然后以尾靜脈注射的方法將TPEDC納米顆粒(TPEDC用量為8 mg/kg)注入小鼠體內(nèi), 并利用TPEDC的雙光子熒光對小鼠腦血管進(jìn)行三維雙光子熒光成像[圖14(A～E)]. 在100 μm深處選取了直徑為5 μm的動(dòng)脈進(jìn)行血管閉合實(shí)驗(yàn). 經(jīng)800 nm激光連續(xù)照射約4 min后, 掃描區(qū)域內(nèi)血管的熒光幾乎消失了, 表示血管閉合的成功[圖14(F,G)]. 而作為對比, 當(dāng)使用相同劑量不具備光敏性能的Luminicell納米顆粒(商業(yè)化的一種AIE納米顆粒, 已經(jīng)被用于雙光子成像)作為血管成像試劑時(shí), 在同等條件下, 血管幾乎不產(chǎn)生任何變化[圖14(H,I)]. 證明圖14(G)中血管的閉合確實(shí)是由雙光子激發(fā)TPEDC納米顆粒所產(chǎn)生的單線態(tài)氧造成的, 這也是基于AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力在活體層面上的又一成功案例.

Fig.14 Two-photon excited brain-blood-vessel closure results of TPEDC (A, B): 3D reconstruct(A) and Z-projection(B) of two-photon images of brain blood vessels. (C—E): Two-photon images of brain blood vessels at different vertical depths: 70 μm(C), 140 μm(D), and 200 μm(E). (F, G): Pre-irradiation(F) and post-irradiation(G) images of the brain blood vessels of mouse treated with TPEDC NPs(8 mg/kg based on TPEDC) and two-photon excitation. (H, I): Pre-irradiation(H) and post-irradiation(I) images of the brain blood vessels of a mouse treated with Luminicell NPs and two-photon excitation. The scanned areas are highlighted by white squares. Two-photon excitation condition: 800 nm, 30 mW; λex: 800 nm; λem: 590—630 nm.Reproduced with permission from Ref.[38], Copyright 2017, Wiley-VCH.

3 總結(jié)與展望

自從AIE光敏劑的雙光子光動(dòng)力治療被報(bào)道以來, 其在光動(dòng)力治療領(lǐng)域已經(jīng)顯示出療效好及精準(zhǔn)度高等優(yōu)勢, 因而獲得了多方關(guān)注. 兼具較大的雙光子吸收截面和較高的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率的AIE光敏劑是此領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵. 目前, 此類光敏劑大多是通過對給體和受體的精準(zhǔn)調(diào)控來設(shè)計(jì)的, 難度相對較高. 聚合增強(qiáng)雙光子光敏效應(yīng)為設(shè)計(jì)可雙光子激發(fā)的AIE光敏劑提供了一條捷徑, 基于此思想, 后續(xù)可以開發(fā)出性能更加優(yōu)異的光敏劑. 此外, 該領(lǐng)域?qū)儆谌骂I(lǐng)域, 科學(xué)家們目前主要是在溶液中和細(xì)胞層面上研究其相關(guān)性質(zhì), 而對其在活體動(dòng)物上的驗(yàn)證還有所欠缺. 目前, 也僅有兩例工作與活體動(dòng)物相關(guān): 其一是在斑馬魚幼苗上實(shí)現(xiàn)了肝癌的治療; 其二是在小鼠腦部血管實(shí)現(xiàn)了光控血管閉合. 因此設(shè)計(jì)性能優(yōu)異的光敏劑, 并在活體動(dòng)物上驗(yàn)證其雙光子光動(dòng)力的療效, 將成為該領(lǐng)域內(nèi)的研究重點(diǎn). 由于雙光子激發(fā)的效率問題, 其進(jìn)行光動(dòng)力治療時(shí)的療效往往要低于傳統(tǒng)的單光子光動(dòng)力治療, 但其具有單光子激發(fā)所不具備的高精準(zhǔn)度和穿透深度. 因此, 雙光子技術(shù)更加適用于病灶部位在腦部和眼部等相對復(fù)雜部位的光動(dòng)力治療, 這也是將來雙光子光動(dòng)力甚至多光子光動(dòng)力在臨床轉(zhuǎn)化時(shí)的方向.