霉菌毒素單獨(dú)或聯(lián)合暴露對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性作用研究進(jìn)展

凌阿茹，孫玲偉，孫詩(shī)謠，戴建軍，張德福，楊俊花，趙志輝,#

1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403 2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306 3. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106

霉菌毒素(mycotoxins)，是一類由霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝物，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康[1]。霉菌毒素在飼料或玉米、小麥和高粱等飼料原料及其他糧油食品中廣泛存在，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)、嘔吐毒素(deoxynivalenol, DON)、T-2毒素和玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)等霉菌毒素最為常見，通常還伴有其代謝產(chǎn)物的協(xié)同污染[2]。霉菌毒素污染具有多樣性和廣泛性，其不僅在各類飼料或飼料原料中存在，還能在動(dòng)物體內(nèi)殘留[3]，對(duì)動(dòng)物或人類產(chǎn)生一定危害，包括免疫毒性、神經(jīng)毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、腸毒性以及生殖毒性等[4]。流行病學(xué)研究表明，近年來(lái)中國(guó)男性精液質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，男性不育癥發(fā)病率顯著提高，這可能與環(huán)境中的霉菌毒素等內(nèi)分泌干擾污染物密切相關(guān)[5-6]。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells, LCs)又稱睪丸間隙細(xì)胞，是人和動(dòng)物體內(nèi)合成與分泌睪酮的主要細(xì)胞，分布在生精小管間的疏松結(jié)締組織之中，其數(shù)量約占睪丸細(xì)胞總量的2%～4%[7]。LCs對(duì)維持機(jī)體生殖系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義，其對(duì)機(jī)體的影響是通過(guò)睪酮合成和分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的，包括刺激雄性動(dòng)物內(nèi)(外)生殖器發(fā)育成熟和維持其生理機(jī)能、促進(jìn)精子生成和成熟以及作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控雄性動(dòng)物性行為等[8-9]。而且研究表明，LCs等生殖細(xì)胞易受霉菌毒素侵害影響雄性生殖功能[10]。因此，LCs能夠作為探究霉菌毒素引起生殖毒性機(jī)制的良好體外模型。

目前，關(guān)于霉菌毒素對(duì)LCs的毒性作用研究報(bào)道較少，且多集中于ZEA和T-2等單一毒素對(duì)LCs的毒性作用機(jī)制研究[11-15]。因此，本文就霉菌毒素對(duì)LCs的毒性作用研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以此為霉菌毒素對(duì)LCs的毒性作用機(jī)制研究提供思路和理論支持。

1 ZEA對(duì)LCs的毒性作用研究(Study on the toxicity of ZEA to LCs)

ZEA是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種非甾體雌激素類霉菌毒素，是玉米、大麥、小麥和高粱等谷物及其副產(chǎn)品中污染最普遍的毒素之一[16]。ZEA能夠引起雄性動(dòng)物發(fā)生生殖障礙，降低公豬睪酮含量和精子質(zhì)量，破壞精細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和精子活力[17]。ZEA的細(xì)胞毒性通常表現(xiàn)為誘發(fā)細(xì)胞凋亡/自噬，抑制蛋白質(zhì)、DNA或RNA的合成，引起氧化應(yīng)激和線粒體損傷等[18]。因此，本文從以下幾個(gè)方面探討其對(duì)LCs的毒性作用機(jī)制。

1.1 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡/自噬

細(xì)胞凋亡和自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和動(dòng)態(tài)平衡等生物功能十分重要。有研究表明，在一定環(huán)境下自噬與凋亡之間存在復(fù)雜的聯(lián)系：自噬是凋亡的前提、自噬抑制凋亡的發(fā)生或者自噬與凋亡共同引起細(xì)胞死亡[19]。甄建偉[11]發(fā)現(xiàn)不同濃度的ZEA均能誘導(dǎo)豬LCs發(fā)生凋亡，Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)量比值(Bax/Bcl-2)也呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。這說(shuō)明，低劑量ZEA暴露時(shí)主要誘導(dǎo)LCs發(fā)生凋亡；在高濃度時(shí)則由誘導(dǎo)凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)橹聣乃雷饔?。Yang等[20]也發(fā)現(xiàn)ZEA能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、半胱天冬酶依賴性/非依賴性途徑等多種途徑提高山羊LCs凋亡和自噬水平，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞死亡。Wang等[21]將大鼠LCs暴露于ZEA后，發(fā)現(xiàn)其不僅通過(guò)上調(diào)Bax的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中觸發(fā)細(xì)胞凋亡增加，還上調(diào)了LC3-II和Bcl-1的表達(dá)，表明ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了高水平的自噬。王亞軍[13]進(jìn)一步使用自噬抑制劑(氯喹)和自噬促進(jìn)劑(雷帕霉素)對(duì)經(jīng)ZEA染毒的LCs進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)激活自噬能夠降低LCs的凋亡率，抑制自噬能夠提高細(xì)胞的凋亡率，說(shuō)明ZEA誘導(dǎo)LCs凋亡的過(guò)程中，自噬可能起保護(hù)作用?？梢姡琙EA能夠通過(guò)誘導(dǎo)LCs發(fā)生凋亡/自噬，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

1.2 引起DNA損傷

DNA作為細(xì)胞內(nèi)具有遺傳信息傳遞作用的一種重要生物大分子，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖起著重要作用。當(dāng)DNA合成受阻或DNA鏈斷裂時(shí)會(huì)間接導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，影響細(xì)胞有絲分裂，改變細(xì)胞周期進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡等[22]。如前所述，甄建偉[11]不僅發(fā)現(xiàn)ZEA會(huì)引起豬LCs的凋亡，還通過(guò)彗星試驗(yàn)觀察到：低劑量ZEA處理會(huì)提高拖尾率，但并不顯著。隨著ZEA染毒劑量增加，細(xì)胞DNA斷裂顯著增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。黃沁怡[23]對(duì)小鼠LCs進(jìn)行了ZEA暴露試驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)低濃度ZEA能夠引起細(xì)胞DNA斷裂，而且隨著劑量增加斷裂變得越來(lái)越顯著，同時(shí)還提高了原癌基因的表達(dá)，降低了抑癌基因的表達(dá)。由此可見，ZEA不僅能夠引起LCs的DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡/自噬，還能夠破壞基因組的穩(wěn)定性，促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

1.3 線粒體損傷

線粒體位于細(xì)胞核外，其不僅是細(xì)胞產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，還能夠攜帶遺傳信息，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂、代謝衰老等過(guò)程，具有重要意義[24]。鄭王龍等[12]對(duì)暴露于ZEA后的豬LCs進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的線粒體膜電位下降，且線粒體出現(xiàn)空泡化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂等結(jié)構(gòu)性改變，從而進(jìn)一步引起細(xì)胞不可逆性凋亡。Yang等[20]的研究也證明ZEA會(huì)通過(guò)線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)山羊LCs中的細(xì)胞凋亡及死亡。Li等[25]使用基于蛋白質(zhì)組學(xué)的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)方法鑒定低濃度ZEA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，ZEA通過(guò)促進(jìn)脂肪酸攝取、β-氧化及過(guò)度的氧化應(yīng)激來(lái)增加能量的產(chǎn)生引起線粒體損傷，并抑制類固醇的生成和酯化。線粒體是參與LCs睪酮合成的主要細(xì)胞器之一，所以線粒體損傷不僅與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，還將直接影響睪酮合成分泌[26]。

1.4 抑制睪酮的合成與分泌

睪酮在雄性動(dòng)物精子生成、維持雄性動(dòng)物第二性特征以及影響受精成功率等方面均具有重要作用[27]。Liu等[28]使用低濃度ZEA對(duì)小鼠LCs進(jìn)行染毒處理，發(fā)現(xiàn)ZEA能夠直接抑制LCs合成分泌睪酮，且抑制作用呈時(shí)間依賴性；進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ZEA能夠顯著降低線粒體膜電位以及睪酮合成相關(guān)的17β-羥甾脫氫酶、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶和細(xì)胞色素P450-17α-羥化酶的mRNA表達(dá)水平，增加類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白和3β-羥甾脫氫酶的mRNA表達(dá)水平，顯著升高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平，顯著抑制Nur77的蛋白表達(dá)，這表明ZEA通過(guò)雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)(cAMP途徑)和孤生核受體Nur77表達(dá)共同干擾抑制小鼠LCs睪酮的生物合成。董雙等[29]通過(guò)腹腔注射對(duì)雄性小鼠進(jìn)行ZEA染毒，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著染毒劑量增加，血清中睪酮濃度顯著下降，這與Liu等[28]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明ZEA能夠引起雄性小鼠生殖系統(tǒng)的損傷。Zhou等[30]分別對(duì)大鼠和大鼠LCs進(jìn)行了體內(nèi)和體外ZEA暴露實(shí)驗(yàn)，也呈現(xiàn)相同結(jié)果。因此，體內(nèi)和細(xì)胞試驗(yàn)均證明ZEA會(huì)破壞LCs的增殖發(fā)育，并降低睪酮生成。

2 T-2毒素對(duì)LCs的毒性作用研究(Study on the toxicity of T-2 toxin to LCs)

T-2毒素主要是由寄居在多種農(nóng)作物上的擬枝孢鐮刀菌和三線鐮刀菌等產(chǎn)生，是單端孢霉烯族A類化合物中毒性最強(qiáng)的霉菌毒素[31]。T2毒素通常表現(xiàn)為免疫毒性、神經(jīng)毒性、腸道和肝臟毒性等[32]。然而，目前關(guān)于T-2毒素對(duì)LCs等生殖細(xì)胞的毒性作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。楊建英等[14]使用T-2毒素對(duì)原代小鼠LCs染毒，結(jié)果顯示，隨著染毒劑量增加，細(xì)胞活力呈劑量依賴性降低；不僅如此，與對(duì)照組相比，毒素處理組LCs睪酮分泌量也顯著降低，同樣呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。這說(shuō)明，T-2毒素能夠抑制LCs的活力，破壞其睪酮分泌功能。隨后Yang等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，T-2毒素使與睪酮合成密切相關(guān)的3β-羥基類固醇脫氫酶-1、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶和類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白的mRNA表達(dá)受到抑制，同時(shí)降低相關(guān)酶活性，從而降低睪酮合成和分泌。Wu等[33]的研究表明，T-2毒素對(duì)小鼠LCs的毒性作用表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖，T-2毒素能夠降低細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，提高過(guò)氧化氫酶活性以及活性氧和丙二醛的含量；降低線粒體膜電位的同時(shí)降低線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ含量；還增加了應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白ASK、p38和JNK的表達(dá)，上調(diào)了CypD、Bax和Bak蛋白表達(dá)，下調(diào)了Bcl-2、Bcl-xl和cyt c蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見，T-2毒素是通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。Zhang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，T-2毒素能夠引起小鼠LCs發(fā)生氧化應(yīng)激而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。由于DNA對(duì)有毒物質(zhì)產(chǎn)生的活性氧敏感，所以氧化應(yīng)激能夠引起DNA損傷，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[35]。這與Yuan等[36]的研究結(jié)果一致，其結(jié)果表明，T-2毒素能夠誘導(dǎo)小鼠LCs發(fā)生氧化應(yīng)激而引發(fā)DNA損傷。已有多項(xiàng)研究表明，T-2毒素能夠誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞[37]和人正常肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)[38]等的自噬，但目前除Yang等[39]報(bào)道T-2毒素能夠誘導(dǎo)小鼠原代LCs發(fā)生高水平的自噬外，未見有其他關(guān)于T-2毒素引起LCs發(fā)生自噬的報(bào)道。

3 其他霉菌毒素對(duì)LCs的毒性作用研究(Study on the toxicity of other mycotoxins to LCs)

霉菌毒素種類繁多，地域分布廣泛，污染基質(zhì)多樣，極易對(duì)人和動(dòng)物造成多種傷害[40]。除上述提到的ZEA和T-2毒素對(duì)LCs的毒性作用研究外，Krisztina等[41]發(fā)現(xiàn)OTA能夠影響公豬精子生成和降低精液質(zhì)量，但未闡明毒素和生殖細(xì)胞之間的具體作用關(guān)系。在LCs中，雌激素等類固醇生成主要由促黃體生成激素(luteinizing hormone, LH)調(diào)節(jié)[42]。Kalayou等[43]發(fā)現(xiàn)當(dāng)未經(jīng)LH處理的原代仔豬LCs暴露于10 μmol·L-1的恩鐮孢菌素B(enniatin B, ENN B)時(shí)，雌二醇和睪酮分泌水平顯著下降；而經(jīng)LH處理的原代仔豬LCs暴露于高濃度(>10 μmol·L-1)的ENN B時(shí)，雌二醇和睪酮分泌水平同樣顯著降低。這說(shuō)明，經(jīng)ENN B處理的LCs中類固醇水平的降低與細(xì)胞毒性相關(guān)，但不是特定的拮抗作用。

除了對(duì)單一毒素的研究，Eze等[44]分別研究了AFB1、DON、ZEA、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZOL)和OTA共6種霉菌毒素單一和二元聯(lián)合對(duì)小鼠LCs活力的影響，結(jié)果顯示：在單一劑量刺激下，DON對(duì)小鼠LCs毒性最強(qiáng)，其次是α-ZOL、OTA、ZEA、β-ZOL和AFB1；二元毒素聯(lián)合處理時(shí)，不同濃度聯(lián)合處理呈現(xiàn)的聯(lián)合作用類型(拮抗、協(xié)同和疊加作用)不同，但未闡述具體作用機(jī)制。Savard等[45]的研究表明，DON和ZEA單獨(dú)或聯(lián)合處理均會(huì)直接影響小鼠LCs合成和分泌生殖激素，且該細(xì)胞對(duì)DON更敏感，當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)對(duì)生殖激素的合成不存在協(xié)同作用。

4 總結(jié)與展望(Summary and prospect)

筆者總結(jié)分析了常見霉菌毒素對(duì)LCs毒性作用的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)關(guān)于霉菌毒素對(duì)LCs的毒性作用機(jī)制研究目前主要集中在ZEA和T-2毒素單獨(dú)暴露對(duì)LCs的毒性作用研究上。事實(shí)上，霉菌毒素往往構(gòu)成多種毒素協(xié)同污染。現(xiàn)有的研究中，僅有少量涉及部分常見霉菌毒素對(duì)LCs的二元聯(lián)合作用，且未闡明具體機(jī)制。因此，除了需要加強(qiáng)其他常見毒素單一暴露對(duì)LCs的毒性作用研究外，還應(yīng)考慮到多種毒素共同暴露對(duì)LCs聯(lián)合毒性的研究，以期為控制和緩解霉菌毒素暴露對(duì)男性生殖健康的危害提供一定的理論基礎(chǔ)和研究思路。