無機(jī)砷在淡水底棲動(dòng)物搖蚊幼蟲中的吸收和累積

王曉輝，楊常亮，鄭王媛淇，王潔，張璟，黃中情

1. 云南大學(xué)建筑與規(guī)劃學(xué)院，昆明 650091 2. 云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650091 3. 云南大學(xué)國際河流與生態(tài)安全研究院，昆明 650091

砷(As)是一種典型的毒害性類金屬元素，是人體非必需元素，毒性強(qiáng)，且具有蓄積性，對(duì)人的中毒劑量為0.0052～0.01 g，致死量為0.2～0.06 g，一直是毒害類元素研究的重要對(duì)象[1]。As多以各種化合物的形式廣泛存在于自然界中，具有低劑量高毒性、價(jià)態(tài)多變和難降解等特征。As及其化合物是具有危害性的重要環(huán)境污染物，危害生態(tài)環(huán)境，嚴(yán)重威脅著人體健康[2]。它已被世界衛(wèi)生組織(WHO)、國際癌癥研究會(huì)(IARC)和美國疾病控制中心等國際權(quán)威機(jī)構(gòu)確認(rèn)為A類致癌物[3]。

由于人類活動(dòng)，使得大量的As釋放到水環(huán)境中，導(dǎo)致沉積物、水和底棲無脊椎動(dòng)物中的As濃度很高。目前，世界各地均有河流湖泊受到As的污染，例如，法國Presa河從1880年至1945年因礦石開采而受到As的廣泛污染，每年含As廢棄物排放量高達(dá)4 000 t。由于采礦廢棄物排放到淡水系統(tǒng)中，導(dǎo)致水、沉積物和底棲無脊椎動(dòng)物中的As濃度分別高達(dá)3 010、9 450和1 928 μg·g-1[4-6]，此As濃度是流動(dòng)水域中所檢測(cè)到的最高濃度[7]。Foley等[8]報(bào)道了美國Chautauqua湖中As濃度為22.4～114.8 μg·L-1，超過了美國公共衛(wèi)生服務(wù)部(US PHS)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)(10 μg·L-1)。近幾十年來，隨著我國湖泊流域人口增長與經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化和城市化活動(dòng)排放進(jìn)入湖泊的各類污染物質(zhì)劇增，我國河流湖泊的As污染呈現(xiàn)出集中、多發(fā)的趨勢(shì)。湖泊水環(huán)境污染不斷加劇，大部分河流湖泊中溶解態(tài)As的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了世界淡水中溶解態(tài)As的平均背景濃度(1.0×10-4mg·L-1)[9-10]。在中國臺(tái)灣，由于采礦和疏浚沉積物造成地下水污染，其中As的濃度高達(dá)0.5 mg·L-1[11]；在中國廣州的珠江，因長期密集的工業(yè)和城市活動(dòng)，其沉積物中總As濃度范圍為16.7～33.4 mg·kg-1[12]。As污染已成為全球關(guān)切的重大環(huán)境與健康問題之一，對(duì)As污染所導(dǎo)致的環(huán)境與健康問題已有大量的研究報(bào)道[1,13]。

人們很早就認(rèn)識(shí)到As是一種普遍存在于食品、水、土壤和空氣中的化學(xué)物質(zhì)[14]。在水環(huán)境中，As可以以多種氧化態(tài)和化學(xué)形態(tài)存在[15]，不同的氧化態(tài)和化學(xué)形態(tài)會(huì)影響其生物利用度和生理毒性效應(yīng)[16]。As在自然界中存在4種氧化態(tài)(+5，+3，0，-3)，而水環(huán)境中最常見的無機(jī)As形態(tài)是砷酸鹽(As(Ⅴ))和亞砷酸鹽(As(Ⅲ))[17]。有機(jī)體中As的毒性決定于As的濃度和形態(tài)[18-19]，無機(jī)As具有極強(qiáng)的毒性[20]，而有機(jī)As，像砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)和部分砷糖(AsS)則被認(rèn)為是低毒性的[21-22]。長期的As暴露研究表明，As可通過飲水或沿著食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致皮膚、肺、肝、腎和膀胱等器官的病變，乃至誘發(fā)癌癥[17,23]，因此，了解As在食物鏈中積累和轉(zhuǎn)化的機(jī)制對(duì)于評(píng)估As污染(特別是食物中)至關(guān)重要。通常認(rèn)為，在食物網(wǎng)中隨著生物體營養(yǎng)等級(jí)的升高，生物體內(nèi)重金屬As的累積量會(huì)逐漸升高，從而產(chǎn)生生物放大作用[24]。金屬的生物累積性是相關(guān)水體污染狀況的標(biāo)志，并且是研究高等水生生物體(尤其是魚類)中金屬的生物學(xué)作用的一個(gè)有用工具[25]。在這種情況下，底棲動(dòng)物作為水生系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分和高營養(yǎng)級(jí)生物體的食物，在天然食物網(wǎng)生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。

迄今為止，關(guān)于在As(Ⅲ)或As(Ⅴ)暴露后的生物累積已在許多物種中有過研究報(bào)道，包括真菌[26]、細(xì)菌[27]、海藻[28]、多毛類[29]和海洋魚類[30]。但是，水生系統(tǒng)中As的研究主要集中在海洋生態(tài)系統(tǒng)，而淡水生態(tài)系統(tǒng)中的As污染研究，尤其是淡水底棲生物對(duì)As的累積方面的研究報(bào)道還很少[7]。搖蚊幼蟲廣泛分布于湖泊和河流的沉積物中，并且能耐受高濃度痕量元素的污染，因此常用于評(píng)估痕量元素的生物可利用度，多項(xiàng)研究表明，搖蚊幼蟲在旨在保護(hù)底棲生物群落和以其為食的高營養(yǎng)級(jí)捕食性動(dòng)物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有重要的作用[31-32]。本研究的目的是監(jiān)測(cè)淡水底棲無脊椎動(dòng)物搖蚊幼蟲(chironomid larvae)對(duì)As的生物累積，了解水相攝入途徑中As的生物可利用度。探究淡水底棲動(dòng)物對(duì)As的累積以評(píng)估潛在的危害及自然風(fēng)險(xiǎn)，為保護(hù)區(qū)域環(huán)境與人類健康提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)生物

搖蚊幼蟲于2018年1月購自天津市一家鮮活搖蚊幼蟲批發(fā)公司。為了盡量減少樣品尺寸對(duì)As暴露實(shí)驗(yàn)的影響，挑選大小基本一致的個(gè)體(體長1.5 cm)。在運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，用去離子水對(duì)搖蚊幼蟲進(jìn)行反復(fù)徹底的漂洗以除去污泥雜質(zhì)等表面附著物以及死蟲，然后放入已曝氣過的自來水中暫養(yǎng)(13 ℃，pH 7.5)，以便達(dá)到凈化和馴化的目的。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)期間，光暗循環(huán)周期為12 h∶12 h，2 d換水一次。在暴露實(shí)驗(yàn)開始之前，在此條件下適應(yīng)培養(yǎng)一周左右。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將搖蚊幼蟲隨機(jī)均勻分開，放入盛有3 L已曝氣過的自來水的容積為5 L的聚乙烯塑料燒杯中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置8個(gè)不同的暴露組和1個(gè)空白對(duì)照組。暴露組的質(zhì)量濃度梯度分別為50、100、500和1 000 μg·L-1的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，空白對(duì)照組使用已曝氣過的脫氯自來水，不添加無機(jī)As。各個(gè)暴露組的含As水溶液通過加入適當(dāng)體積的1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(NaAsO2或Na2HAsO47H2O)來配制。每實(shí)驗(yàn)組各放入25 g經(jīng)馴養(yǎng)凈化后的搖蚊幼蟲，保持室溫和自然光照，在靜態(tài)淡水條件下進(jìn)行為期18 d的暴露培養(yǎng)。暴露期間定期取水樣檢測(cè)水中As濃度，每天及時(shí)移除死蟲。實(shí)驗(yàn)過程中分別在第0、3、6、9、12、15和18天取樣，每組實(shí)驗(yàn)每次采集3個(gè)平行樣本。首先，將所取水樣放于5 mL聚乙烯離心管中并立即放入-20 ℃的冰箱中保存；其次，將收集的存活的紅蟲短暫浸入去離子水中，然后用紙巾將多余的水分吸干，用萬分之一天平稱量記錄其濕重，之后將搖蚊幼蟲進(jìn)行冷凍干燥(用萬分之一天平稱量記錄其干重)以及均質(zhì)化(研磨)，最后儲(chǔ)存在小型聚乙烯袋中，以便進(jìn)一步用于總As濃度的分析。

在搖蚊幼蟲的不同暴露組和空白對(duì)照組中，其平均濕重和干重都沒有明顯的差異，所以這些參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)的影響可以忽略。As(Ⅴ)暴露組中搖蚊幼蟲的平均濕重為(1.00±0.06) g，范圍在0.81～1.19 g之間；平均干重為(0.13±0.03) g，范圍在0.08～0.25 g之間。As(Ⅲ)暴露組中搖蚊幼蟲的平均濕重為(0.97±0.08) g，范圍在0.76～1.17 g之間；平均干重為(0.14±0.02) g，范圍在0.10～0.20 g之間?？瞻讓?duì)照組中搖蚊幼蟲的平均濕重為(1.01±0.10) g，范圍在0.91～1.31 g；平均干重為(0.14±0.02) g，范圍在0.10～0.20 g之間。

1.3 總As濃度分析

1.3.1 水樣總As濃度測(cè)定

將冰凍的水樣從冰箱取出，解凍后用于總As濃度分析。無機(jī)As濃度參照中華人民共和國水利行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì) 砷的測(cè)定 原子熒光光度法》(SL.327.1—2005)[33]測(cè)定：準(zhǔn)確移取適量水樣(視濃度而定，精確至0.1 mL)置于50 mL容量瓶中，依次加入體積分?jǐn)?shù)為50%的鹽酸(32%，優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁試劑公司)水溶液10.0 mL、硫脲+抗壞血酸(50 g·L-1，分析純，上海阿拉丁試劑公司)混合溶液5.0 mL，用純水定容后搖勻，放置30 min后待測(cè)。同時(shí)按同樣的方法制備空白樣品。采用高效液相色譜-紫外-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀(HPLC-UV-HG-AFS)(LC-AFS 9600，北京海光儀器有限公司)測(cè)定水樣中總As濃度(μg·L-1)。

1.3.2 生物樣品總As濃度測(cè)定

采用濕法消解制備搖蚊幼蟲樣品，其無機(jī)As濃度參照《食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》(GB5009.11—2003)[34]中無機(jī)As氫化物原子熒光光度法測(cè)定：準(zhǔn)確稱量部分均勻樣品粉末(0.05 g)，置于50 mL錐形瓶中，依次加入硝酸(65%，優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁試劑公司)20 mL，硫酸(98%，優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁試劑公司)1.25 mL，高氯酸(72%，優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁試劑公司)4 mL，放置過夜，次日置于電熱板(XMTD-9000，天津工業(yè)實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)上加熱消解。若消解液處理至1 mL左右時(shí)仍有未分解物質(zhì)或色澤變深，取下放冷，補(bǔ)加硝酸5～10 mL，再消解至2 mL左右，如此反復(fù)2～3次，注意避免炭化，繼續(xù)加熱至消解完全后，再持續(xù)蒸發(fā)至高氯酸的白煙散盡，硫酸的白煙開始冒出。取下放冷，之后加去離子水25 mL，再蒸發(fā)至冒硫酸白煙，冷卻，用去離子水將內(nèi)溶物轉(zhuǎn)入25 mL比色管中。最后加入硫脲+抗壞血酸(100 g·L-1，分析純，上海阿拉丁試劑公司)混合溶液2 mL，補(bǔ)加去離子水至刻度，混勻，放置30 min，待測(cè)，使用相同的操作程序處理空白樣品。采用HPLC-UV-HG-AFS(LC-AFS 9600，北京海光儀器有限公司)測(cè)定搖蚊幼蟲組織樣品中的As濃度(μg·g-1干重)。

總As標(biāo)準(zhǔn)溶液是將總As標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)連續(xù)稀釋制備的。本次實(shí)驗(yàn)水樣總As以及生物樣品總As濃度的測(cè)定均采用HPLC-UV-HG-AFS(LC-AFS 9600，北京海光儀器有限公司)。先測(cè)量樣品空白，之后按順序測(cè)定各樣品濃度。依次測(cè)定試劑空白、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液總As濃度，相同條件下，測(cè)定樣品溶液總As濃度。通過分析加標(biāo)回收率，證實(shí)了所采用消化方法的準(zhǔn)確性。水樣總As濃度加標(biāo)回收率在109.4%～119.6%之間，搖蚊幼蟲樣品總As濃度加標(biāo)回收率在99.1%～118.6%之間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過單因素方差分析(ANOVA)來檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中的相關(guān)水平差異，然后進(jìn)行最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)。概率水平P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用OriginPro 2016作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 水溶液中的As濃度

搖蚊幼蟲暴露于無機(jī)As 18 d后，不同濃度梯度的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)暴露組中水體總As濃度及其變化情況如表1所示?？瞻讓?duì)照組中水體總As濃度范圍在0.753～0.824 μg·L-1之間。在As(Ⅲ)暴露實(shí)驗(yàn)中，除50 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組中水體As濃度隨時(shí)間變化無明顯差異(P>0.05)外，其他As(Ⅲ)暴露組(100、500和1 000 μg·L-1)中水體As濃度均在15 d后相較于初始暴露濃度有了顯著增加(P<0.05)。在整個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)期間，As(Ⅲ)暴露組中水體As濃度誤差范圍保持在2.70%～13.90%之間。而在As(Ⅴ)暴露實(shí)驗(yàn)中，100 μg·L-1和500 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組中水體As濃度隨時(shí)間變化不顯著(P>0.05)，僅50 μg·L-1和1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組中水體As濃度分別在18 d和15 d后與初始暴露濃度相比有了顯著差異(P<0.05)。在整個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)周期中，As(Ⅴ)暴露組中水體As濃度誤差范圍為2.65%～18.12%。這表明，在短時(shí)間內(nèi)，水體中As濃度隨時(shí)間變化不顯著，As暴露濃度無明顯變化差異。

2.2 暴露時(shí)間對(duì)搖蚊幼蟲中As累積的影響

搖蚊幼蟲暴露于無機(jī)As水溶液中18 d后，在不同濃度梯度的As(Ⅲ)或As(Ⅴ)暴露組中，其生物體組織中As的累積隨時(shí)間變化情況如圖1和圖2所示。在對(duì)照組中，搖蚊幼蟲中As濃度較低，且隨時(shí)間沒有顯著性變化，總As濃度范圍為1.16～1.22 μg·g-1(干重)，這些數(shù)值處于淡水湖泊生物體中常見的As濃度范圍的下限。

表1 不同濃度無機(jī)As暴露實(shí)驗(yàn)水溶液中總As濃度Table 1 Total arsenic concentration in water under exposure treatments of inorganic As with different concentrations

圖1 暴露于不同濃度As(Ⅲ)水溶液18 d后搖蚊幼蟲中總As濃度變化注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。Fig. 1 Changes of total arsenic concentrations in chironomid larvae after waterborne As(Ⅲ) exposure for 18 dNote: Data are expressed as means±SD (n=3).

圖2 暴露于不同濃度As(Ⅴ)水溶液18 d后搖蚊幼蟲中總As濃度變化注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。Fig. 2 Changes of total arsenic concentrations in chironomid larvae after waterborne As(Ⅴ) exposure for 18 dNote: Data are expressed as means±SD (n=3).

與空白對(duì)照組相比，不同濃度的As(Ⅲ)暴露組中搖蚊幼蟲體內(nèi)As濃度隨時(shí)間呈總體上升趨勢(shì)。50 μg·L-1和100 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組中總As濃度在前12 d內(nèi)變化均趨于平緩且差異不大，總As濃度范圍分別為1.23～1.40 μg·g-1(干重)和1.11～1.34 μg·g-1(干重)，而在12～18 d的暴露周期內(nèi)，50 μg·L-1和100 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組中總As濃度有小幅度上升趨勢(shì)，變化較為明顯，且在第18天時(shí)，搖蚊幼蟲體內(nèi)As的累積量達(dá)到最大值，分別為(2.01±0.20) μg·g-1(干重)和(2.60±0.50) μg·g-1(干重)。500 μg·L-1和1 000 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組中總As濃度在前12 d內(nèi)同樣呈平緩趨勢(shì)，但搖蚊幼蟲體內(nèi)As的累積量略有增加，總As濃度范圍分別為1.36～1.86 μg·g-1(干重)和1.76～2.45 μg·g-1(干重)，而在12～18 d的暴露周期內(nèi)，總As濃度同樣呈大幅度上升趨勢(shì)，且在第18天時(shí)，搖蚊幼蟲體內(nèi)As的累積量達(dá)到最大值，分別為(4.10±0.17) μg·g-1(干重)和(7.14±0.48) μg·g-1(干重)(圖1)?？梢?，在不同濃度梯度的As(Ⅲ)暴露組中，隨著時(shí)間的改變，搖蚊幼蟲體內(nèi)As的累積量均有較大變化，表明As的累積與暴露時(shí)間有關(guān)。可能在高濃度As(Ⅲ)的脅迫下，進(jìn)入搖蚊幼蟲體內(nèi)的無機(jī)As遠(yuǎn)大于代謝排出的無機(jī)As，造成無機(jī)As在搖蚊幼蟲體內(nèi)的快速積累，如果無機(jī)As在搖蚊幼蟲體內(nèi)蓄積的濃度達(dá)到一定值，會(huì)對(duì)搖蚊幼蟲產(chǎn)生毒害作用，影響到搖蚊幼蟲的代謝活動(dòng)和攝食活動(dòng)等，最終導(dǎo)致其死亡。本實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲大量異常死亡，說明所采用的As(Ⅲ)濃度還不足以使搖蚊幼蟲致死。

與As(Ⅲ)暴露組不同，As(Ⅴ)暴露組中搖蚊幼蟲體內(nèi)As濃度隨時(shí)間變化是總體上呈先上升、后下降、最后趨于平緩或持續(xù)上升趨勢(shì)。在前12 d的暴露周期內(nèi)，50、100、500和1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度均是有小幅度上升，之后呈下降趨勢(shì)，總As濃度范圍分別為1.33～1.73 μg·g-1(干重)、1.46～2.07 μg·g-1(干重)、1.46～2.34 μg·g-1(干重)和1.61～2.98 μg·g-1(干重)，除50 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度在第9天達(dá)到最大值(1.73±0.24) μg·g-1(干重)之外，100、500和1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度均在第6天達(dá)到最大值，分別為(2.07±0.10) μg·g-1(干重)、(2.35±0.16) μg·g-1(干重)和(2.98±0.93) μg·g-1(干重)(圖2)，這表明搖蚊幼蟲對(duì)As的累積能力隨著暴露條件變化而變化，高代謝期和As的排泄期與As在其組織中的累積是相互交替進(jìn)行的。搖蚊幼蟲組織直接與淡水中的As(Ⅴ)接觸時(shí)，可能存在一定的解毒機(jī)制。當(dāng)組織內(nèi)As的累積量達(dá)到一定值后，其代謝速率可能大于吸收速率。而在12～18 d的暴露周期內(nèi)，As(Ⅴ)暴露組總As濃度上升至最大值后均趨于平緩，其搖蚊幼蟲中體內(nèi)As累積量的最大值分別為(1.86±0.08) μg·g-1(干重)、(1.89±0.28) μg·g-1(干重)和(2.07±0.03) μg·g-1(干重)(圖2)，與前12 d內(nèi)對(duì)應(yīng)的As(Ⅴ)暴露組中搖蚊幼蟲體內(nèi)總As濃度的最大值非常接近，表明搖蚊幼蟲對(duì)As的累積趨于穩(wěn)定。1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度呈持續(xù)上升趨勢(shì)，這與1 000 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組的情況相似，且在第18天時(shí)，搖蚊幼蟲體內(nèi)As累積量達(dá)到(2.85±0.76) μg·g-1(干重)(圖2)。

2.3 無機(jī)As暴露濃度和形態(tài)對(duì)搖蚊幼蟲中As累積的影響

如圖3和圖4所示，在搖蚊幼蟲暴露于無機(jī)As不同時(shí)間后，其體內(nèi)As的累積隨著暴露濃度的升高均有增加，并且As(Ⅴ)暴露組總As濃度明顯低于As(Ⅲ)暴露組。對(duì)As(Ⅲ)暴露組而言，除在500 μg·L-1As(Ⅲ)暴露3 d的搖蚊幼蟲體內(nèi)總As濃度沒有顯著增加外，500 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組(6、9、12、15和18 d)和1 000 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組(3、6、9、12、15和18 d)

圖3 不同濃度As(Ⅲ)暴露條件下?lián)u蚊幼蟲中總As濃度注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示不同處理組間的差異顯著，P<0.05。Fig. 3 Total arsenic concentrations in chironomid larvae exposed to different concentrations of As(Ⅲ)Note: Data are expressed as means±SD (n=3); different letters represent significant difference between treatments (P<0.05).

總As濃度與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，然而，50 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組(3、6、9、12和15 d)和100 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組(3、6和9 d)的搖蚊幼蟲體內(nèi)總As濃度與對(duì)照組相比均沒有顯著性差異，并且50 μg·L-1和100 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組總As濃度非常接近(圖3)。另外，除12 d時(shí)所有As(Ⅴ)暴露組總As濃度與對(duì)照組沒有顯著差異外，3、6、9、15和18 d時(shí)，1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，3、6、9和15 d時(shí)，500 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組的搖蚊幼蟲總As濃度與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，9 d和15 d時(shí)，50 μg·L-1和100 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組搖蚊幼蟲體內(nèi)總As濃度與對(duì)照組相比有了顯著增加(P<0.05)，同樣的，50 μg·L-1和100 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度非常接近(圖4)。由此可見，較高的As暴露濃度(500 μg·L-1和1 000 μg·L-1As(Ⅲ)、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1As(Ⅴ))可能會(huì)影響搖蚊幼蟲對(duì)As(Ⅲ)和As(Ⅴ)生物累積的模式，在低濃度無機(jī)As暴露條件下，搖蚊幼蟲對(duì)As的生物利用度較低。值得注意的是，在無機(jī)As暴露18 d后，As(Ⅲ)暴露組總As濃度與對(duì)照組相比均有顯著增加(P<0.05)(圖3)，而對(duì)于As(Ⅴ)暴露組，僅僅1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度與對(duì)照組相比顯著增加(P<0.05)(圖4)，在1 000 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組的搖蚊幼蟲體內(nèi)As的累積量高于1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組，這表明，在高濃度的無機(jī)As暴露條件下，對(duì)于搖蚊幼蟲來說，As(Ⅲ)可能比As(Ⅴ)更具生物可利用性。

圖4 不同濃度As(Ⅴ)暴露條件下?lián)u蚊幼蟲中總As濃度注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；不同字母表示不同處理組間的差異顯著，P<0.05。Fig. 4 Total arsenic concentrations in chironomid larvae exposed to different concentrations of As(Ⅴ)Note: Data are expressed as means±SD (n=3); different letters represent significant difference between treatments (P<0.05).

如圖5所示，暴露于As(Ⅲ)不同時(shí)間后，搖蚊幼蟲中總As濃度與暴露濃度之間呈現(xiàn)顯著的線性相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，其總As濃度隨暴露濃度升高逐漸增加。如圖6所示，在As(Ⅴ)暴露實(shí)驗(yàn)中，除暴露12 d的As(Ⅴ)暴露組搖蚊幼蟲中總As濃度與暴露濃度之間沒有顯著相關(guān)性，其他As(Ⅴ)暴露組(3、6、9、15和18 d)總As濃度與暴露濃度之間均呈顯著的正相關(guān)(P<0.05)。且隨著暴露濃度升高，As(Ⅴ)暴露組搖蚊幼蟲中總As濃度增加趨勢(shì)相對(duì)As(Ⅲ)暴露組更為平緩，又一次表明搖蚊幼蟲對(duì)As(Ⅲ)的生物利用度高于As(Ⅴ)。

圖5 不同濃度As(Ⅲ)暴露條件下?lián)u蚊幼蟲中總As濃度與As(Ⅲ)暴露濃度相關(guān)性分析注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。Fig. 5 Correlation analysis of total As concentrations in chironomid larvae and different As(Ⅲ) exposure concentrationsNote: Data are expressed as means±SD (n=3).

圖6 不同濃度As(Ⅴ)暴露條件下?lián)u蚊幼蟲中總As濃度與As(Ⅴ)暴露濃度相關(guān)性分析注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。Fig. 6 Correlation analysis of total As concentrations in chironomid larvae and different As(Ⅴ) exposure concentrationsNote: Data are expressed as means±SD (n=3).

2.4 生物累積因子(BAF)

美國環(huán)境保護(hù)局(US EPA)提出了一套估算各種污染物的生物累積因子(BAF)的方法和指南，以反映魚類、貝類等水生生物通過各種來源(食物、沉積物等)對(duì)污染物的吸收情況，且不僅限于水中來源[32]。BAF是指特定營養(yǎng)水平下的水生生物體和水中某種化學(xué)物質(zhì)的濃度之比，其中生物體及其食物都暴露于該營養(yǎng)水平下[35-36]。As的BAF可以按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

式中：ct為生物體組織中總As濃度(mg·kg-1干重)，cw為水體中As濃度(mg·L-1)。

在目前的研究中，我們計(jì)算了在無機(jī)As暴露18 d后搖蚊幼蟲對(duì)As的生物累積因子(BAF18 d)，結(jié)果如圖7所示，在As(Ⅲ)和As(Ⅴ)暴露組中，搖蚊幼蟲對(duì)As的BAF18 d隨無機(jī)As暴露濃度的升高呈下降趨勢(shì)，其值從高到低依次為BAF(50 μg·L-1)>BAF(100 μg·L-1)>BAF(500 μg·L-1)>BAF(1 000 μg·L-1)，且在不同的無機(jī)As暴露條件下，As(Ⅲ)暴露組搖蚊幼蟲中BAF均高于As(Ⅴ)暴露組，表明搖蚊幼蟲對(duì)As的生物累積能力隨無機(jī)As暴露濃度的升高而降低，且搖蚊幼蟲對(duì)As(Ⅲ)的累積能力高于As(Ⅴ)。在50、100、500和1 000 μg·L-1As(Ⅲ)暴露組中，搖蚊幼蟲對(duì)As的BAF18 d分別為37.44±4.42、23.90±4.70、7.73±0.50和6.36±0.48，在50 μg·L-1暴露濃度條件下BAF18 d達(dá)到最大值，且在500 μg·L-1和1 000 μg·L-1較高As濃度暴露條件下，搖蚊幼蟲對(duì)As的BAF18 d值非常接近。另外，在50、100、500和1 000 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組中，搖蚊幼蟲對(duì)As的BAF18 d分別為29.04±3.24、14.90±0.62、3.33±0.46和2.27±0.66，同樣也可以發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲在較高的As暴露濃度條件下BAF18 d值較為接近，但低于As(Ⅲ)暴露組。

3 討論(Discussion)

在前12 d的暴露周期內(nèi)，As(Ⅴ)暴露組中搖蚊幼蟲體內(nèi)總As濃度均有小幅度上升，之后呈下降趨勢(shì)，搖蚊幼蟲組織直接與淡水中的As(Ⅴ)接觸時(shí)，可能存在一定的解毒機(jī)制。當(dāng)組織內(nèi)As的累積量達(dá)到一定值后，其代謝速率可能大于吸收速率。Mogren等[37]研究發(fā)現(xiàn)，溪流搖蚊幼蟲(Chironomusriparius)能夠承受相對(duì)高濃度As的長期暴露。諸多研究表明，水生軟體動(dòng)物通常有多種從細(xì)胞中排除有毒化合物的策略，包括：(1)對(duì)金屬的吸收速率和排泄速率具有平衡調(diào)節(jié)機(jī)制；(2)金屬與金屬硫蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)螯合作用，再進(jìn)一步通過溶酶體內(nèi)膜系統(tǒng)將其消除；(3)金屬與谷胱甘肽絡(luò)合，并隔離到液泡中[38]；(4)將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)，然后甲基化為毒性較低的有機(jī)形態(tài)進(jìn)而通過排泄釋放[39]。此外，有研究表明，蛻皮也作為無脊椎動(dòng)物一種解毒重金屬化合物的手段[40]。Mogren等[41]將溪流搖蚊幼蟲(Chironomusriparius)暴露于1 000 mg·L-1As(Ⅴ)中研究其在不同的生活階段個(gè)體中As的濃度及其形態(tài)分布情況，發(fā)現(xiàn)溪流搖蚊在蛹期和成年期時(shí)As濃度顯著降低，表明在幼蟲期到蛹期這一階段一部分As被排出體外，同樣地，在先前的一項(xiàng)研究中，Mogren等[37]發(fā)現(xiàn)溪流搖蚊在四齡期和成年期之間能夠排出72%的總As。而在12～18 d的暴露周期內(nèi)，50、100和500 μg·L-1As(Ⅴ)暴露組總As濃度上升至最大值后均趨于平緩，與前12 d內(nèi)對(duì)應(yīng)的As(Ⅴ)暴露組中搖蚊幼蟲體內(nèi)總As濃度的最大值非常接近，表明搖蚊幼蟲對(duì)As的累積趨于穩(wěn)定。有研究報(bào)道，大多數(shù)海洋動(dòng)物，包括海藻、腹足動(dòng)物、蝦和其他無脊椎動(dòng)物，從海水中累積As的能力有限[28,42-43]。另外，Ciardullo等[44]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒魚各個(gè)組織(鰓、腎臟、肝臟、肌肉和皮膚)中As的生物累積均在14個(gè)月時(shí)達(dá)到峰值，之后在其他生長年齡階段顯著降低，同樣表明As的生物累積能力低。Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，細(xì)鱗鯻(Teraponjarbua)幼魚在100 μg·L-1As(Ⅲ)和As(Ⅴ)中暴露10 d后魚肉中As的累積亦較少。同樣地，菲律賓蛤仔在100 μg·L-1As(Ⅴ)中暴露14 d后鰓組織中總As累積與對(duì)照組相比沒有顯著差異，且肝胰腺和鰓組織中總As濃度增加趨勢(shì)緩慢[45]。以上研究表明無機(jī)As的低生物利用度。

圖7 不同濃度無機(jī)As暴露條件下?lián)u蚊幼蟲生物累積因子注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。Fig. 7 The bioaccumulation factors of chironomid larvae exposed to different concentrations of inorganic AsNote: Data are expressed as means±SD (n=3).

在本研究中，暴露于較高濃度條件下的As(Ⅴ)(500 μg·L-1)的搖蚊幼蟲中總As濃度沒有顯著升高，這再次表明軟體動(dòng)物對(duì)As(Ⅴ)的生物利用度低。相比之下，在As(Ⅲ)暴露條件下的搖蚊幼蟲中As的累積量比在As(Ⅴ)暴露條件下更高，表明當(dāng)暴露于較高濃度的無機(jī)As時(shí)，與As(Ⅴ)相比，As(Ⅲ)對(duì)上皮細(xì)胞更具滲透性或更容易被搖蚊幼蟲代謝。其他研究人員也發(fā)現(xiàn)了類似的研究結(jié)果，Zhang等[46]研究發(fā)現(xiàn)，僧帽牡蠣(Saccostreacucullata)在1 mg·L-1As(Ⅴ)中暴露30 d后，組織中總As濃度與空白對(duì)照組相比沒有顯著增加，在1 mg·L-1As(Ⅲ)中暴露的僧帽牡蠣中總As累積要高于1 mg·L-1As(Ⅴ)暴露組，且在1 mg·L-1As(Ⅲ)暴露下組織中總As濃度與5 mg·L-1As(Ⅴ)暴露組的相當(dāng)。Gailer等[47]研究報(bào)道，藍(lán)貽貝(Mytilusedulis)在100 μg·L-1As(Ⅲ)和As(Ⅴ)暴露10 d后，其組織中總As濃度分別為5.1～6.4 mg·kg-1和3.3～4.8 mg·kg-1(濕重)，與對(duì)照組中藍(lán)貽貝組織總As濃度(4.2～5.1 mg·kg-1(濕重))相比沒有顯著差異，表明As(Ⅲ)和As(Ⅴ)這2種無機(jī)As形態(tài)的生物利用度都非常低，并且As(Ⅲ)在這種軟體動(dòng)物中的生物利用度略高于As(Ⅴ)。Suhendrayatna等[48]發(fā)現(xiàn)，在As(Ⅲ)中暴露的淡水魚類日本青鳉(Oryziaslatipes)中總As累積比在As(Ⅴ)暴露組中高4～10倍，另有研究表明，在As(Ⅲ)中暴露的羅非魚(Tilapiamossambica)組織中總As濃度高于As(Ⅴ)暴露組[49]，這些結(jié)果表明，As(Ⅲ)可能比As(Ⅴ)更容易通過消化道黏膜或更容易被代謝。然而，也有學(xué)者研究了蛤蜊(Gafrariumtumidum)和雙齒圍沙蠶(Nereissuccinea)對(duì)As的生物可利用性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種無脊椎動(dòng)物對(duì)As(Ⅲ)的吸收效率低，As(Ⅲ)更容易被迅速消除[50-51]。

已有研究表明，菲律賓蛤仔[45]和僧帽牡蠣[46]組織中總As的累積隨水體中As暴露濃度的升高成比例增加，這與之前在淡水魚類日本青鳉[48]和羅非魚[49]中的研究結(jié)果類似。Usese等[52]研究發(fā)現(xiàn)，尼日利亞拉各斯舄湖4種底棲性魚類(Chrysichthysnigrodigitatus、Mugilcephalus、Lizafalcipinis和Bathygobioussoporator)的肌肉組織和淡水螺(Tymponotoniusfuscatus)各組織中的As濃度均與水體中As濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。另外，Wang等[53]研究了淡水藻類銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)在不同濃度的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)(0、5、10、20、50和100 μmol·L-1)中暴露15 d后對(duì)As的累積情況，發(fā)現(xiàn)在As(Ⅲ)中暴露的藻細(xì)胞內(nèi)總As濃度顯著高于As(Ⅴ)暴露后的濃度，且銅綠微囊藻累積的總As濃度與添加到生長培養(yǎng)基中的As濃度成正比。在海洋多毛類動(dòng)物雜色沙蠶(Nereisdiversicolor)和環(huán)節(jié)動(dòng)物沙蠶(Nereisvirens)這2種沙蠶的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了從海水中攝入的As濃度隨著砷酸鹽濃度的增加而上升[29]。而Zhang等[54]對(duì)從中國大亞灣海域12個(gè)地點(diǎn)采集的19種野生海洋生物進(jìn)行了總As和As形態(tài)分析，并測(cè)定了海水和沉積物中的As濃度，發(fā)現(xiàn)底棲魚類李氏(Callionymusrichardsonii)和蝦類寬突赤蝦(Metapenaeopsispalmensis)體內(nèi)As濃度與沉積物中As濃度呈顯著正相關(guān)，而中上層魚類二長棘鯛(Parargyropsedita)中的As濃度與沉積物中的As濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。這表明，海洋生物體中的As濃度并不取決于暴露水體中的As濃度，但與沉積物中的As濃度高度相關(guān)。而這些不同海洋生物體中As濃度的差異可能是由于有機(jī)體的選擇性食物來源不同所造成的。

綜上所述，本研究考察了淡水底棲動(dòng)物搖蚊幼蟲經(jīng)不同濃度As(Ⅲ)或As(Ⅴ)水相暴露后，其對(duì)As的吸收和累積情況。在不同濃度梯度的無機(jī)As暴露實(shí)驗(yàn)中，溶液中As濃度隨時(shí)間變化不顯著；搖蚊幼蟲對(duì)As的累積量與暴露時(shí)間長短有關(guān)，對(duì)As(Ⅲ)的累積較As(V)顯著；搖蚊幼蟲對(duì)無機(jī)As的生物利用度較低，在高濃度的無機(jī)As暴露條件下，As(Ⅲ)比As(Ⅴ)更具生物可利用性；暴露于As(Ⅲ)或As(Ⅴ)溶液中的搖蚊幼蟲，其體內(nèi)總As濃度隨無機(jī)As暴露濃度的升高逐漸增加，但生物累積能力隨無機(jī)As暴露濃度的升高反而降低。