五味棗仁顆粒的質(zhì)量規(guī)范研究

張紅巖，成光宇，初洪波，林艷玲，崔 暢

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

五味棗仁顆粒是由酸棗仁、刺五加、五味子、茯苓等原料經(jīng)提取、濃縮、干燥、混合、制粒等工藝制成的保健食品，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明具有輔助改善睡眠功能。為了更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，我們對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，采用薄層色譜法，對(duì)產(chǎn)品中各個(gè)原料進(jìn)行薄層色譜鑒別，得出結(jié)論，五味子的色譜特征明顯，陰性無干擾，重復(fù)性優(yōu)，列入標(biāo)準(zhǔn)正文；此外，采用高效液相色譜法，對(duì)五味棗仁顆粒中酸棗仁所含斯皮諾素進(jìn)行含量測(cè)定研究，建立了測(cè)定方法，對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察。通過以上研究，建立了五味棗仁顆粒質(zhì)量控制方法，為更好保證產(chǎn)品質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（日本島津LC-10ATvp）、色譜工作站（日本LCsolution Lite）、電子分析天平（十萬分之一）（瑞士，梅特勒-托利多XS105 型）、紫外可見分光光度計(jì)（上海恒平科學(xué)儀器有限公司UV-2800 型）、超聲清洗儀（上海 生析超聲儀）、斯皮諾素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111869－201203，含量計(jì)95.4%）、五味子醇甲對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110857－201714，含量計(jì)99.9%）、五味棗仁顆粒（北京海德潤(rùn)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：190401、190402、190403）、乙腈。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子薄層色譜鑒別 取五味子10 g，細(xì)磨，放入60 mL甲醇，置超聲波處理30 min。濾后，將濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使之盡量溶解。應(yīng)用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷的提取液，蒸干，殘?jiān)芳蛹状? mL 溶解，當(dāng)作供試品溶液。拿取五味子醇甲對(duì)照品，將其應(yīng)用甲醇制作成1 mL/1 mg 的溶液當(dāng)作對(duì)照品溶液。（中國(guó)藥典2015年版四部 通則0502實(shí)驗(yàn)。拿取供試品溶液10 μL，和對(duì)照品溶液2 μL，兩者點(diǎn)置相同一個(gè)硅膠GF254薄層板。依據(jù)石油醚（30 ℃～60 ℃）—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1）上層溶液當(dāng)作展開劑，展開，并置晾干燥。擱置紫外燈（254 nm）檢視。對(duì)照品色譜匹配對(duì)應(yīng)的位置上跟供試品顯著同種顏色斑點(diǎn)，見圖1。

圖1 五味子薄層色譜鑒別

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱條件為Hichrom C18（4.6×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈—水（16:84）；檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。理論板數(shù)憑借斯皮諾素峰推出，不得不夠2 000。

2.2.2 制作對(duì)照品溶液 拿取足夠量的斯皮諾素對(duì)照品，稱量精密，放入甲醇制l mL/40 μg 的溶液，可得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下本品適當(dāng)量，研細(xì)，取2 g，準(zhǔn)確稱量置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入70%，25 mL 乙醇。量重后開展超聲波處理（功率為250 w，頻率40 kHz）30 min，取出，置冷并重次量定重量。以70%乙醇補(bǔ)予減少的重量，搖勻過濾且匯集續(xù)濾液，既得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 核查線性范圍 精準(zhǔn)足量稱量斯皮諾素對(duì)照品，混合甲醇制濃度為0.1441 mg/mL 溶液。精準(zhǔn)依序吸量0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL，分置10 mL 量瓶中，取來甲醇稀釋至各量瓶刻度后且搖勻。分別另取量上述對(duì)照品溶液各10 μL，憑據(jù)方法測(cè)定。設(shè)立橫坐標(biāo)斯皮諾素的量，縱坐標(biāo)設(shè)立峰面積，描畫標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.072～1.296 5 μg 之間范疇，斯皮諾素量，峰面積積分值互相存留優(yōu)良線性關(guān)系。回歸方程：Y=2 263 672.93 X+6 620.25，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積積分值，選擇時(shí)間點(diǎn)分別為0、2、4、8、12、24、36、48 h。結(jié)果，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得得峰面積積分值分別為：1 071 800、1 079 037、1 075 475、1 073 717、1 075 998、1 079 360、1 080 823、1 095 603，RSD%=0.68；結(jié)果顯明，樣品中的斯皮諾素2 天內(nèi)情況基本平穩(wěn)。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取10 μL 3.2.3 項(xiàng)下供試品溶液，憑據(jù)已篩選的色譜條件，連續(xù)針對(duì)同一供試品溶液進(jìn)樣6 次，檢測(cè)峰面積的積分值，結(jié)果，樣品中斯皮諾素峰面積積分值分別為：1 047 563、1 053 695、1 059 511、1 059 364、1 057 924、1 056 048，RSD%=0.43。測(cè)定結(jié)果展現(xiàn)，本法設(shè)備精密度優(yōu)良。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 針對(duì)此批次的五味棗仁顆粒樣品依據(jù)3.2.3 項(xiàng)下方法制成供試品溶液，共計(jì)6 份，憑據(jù)方法測(cè)定后測(cè)定的6 次結(jié)果依次是：0.575 3、0.579 3、0.567 5、0.578 5、0.582 1、0.583 8 mg/g，平均值為0.577 8 mg/g，RSD%=1.01。測(cè)定最終結(jié)果表明此方法重復(fù)性優(yōu)。

2.2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取含量已知曉的五味棗仁顆粒6 份樣品（批號(hào)為190401,斯皮諾素的含量57.45 mg/100 g），分別加入一定量斯皮諾素對(duì)照品，依法測(cè)定后計(jì)算出回收率。結(jié)論可得：關(guān)于斯皮諾素的均回收率為98.31%，RSD%=1.2，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.4.6 樣品的測(cè)定 憑據(jù)方法測(cè)定三批試樣品五味棗仁顆粒中的斯皮諾素含量，結(jié)果見表2。

表2 三批五味棗仁顆粒中斯皮諾素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜法 五味子來源五味子科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，大部分出現(xiàn)于遼寧省、吉林省、黑龍江及內(nèi)蒙古等地方，別稱北五味子。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味酸、甘，歸肺、心、腎經(jīng)，主要功效為益氣滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神[1]。五味子包括多種成分，關(guān)鍵含有木脂素、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、三萜、氨基酸及無機(jī)元素等等。其中重要成分為木脂素類物質(zhì)。其含五味子素、五味子甲素、五味子酯甲、新五味子素、五味子酯乙、五味子醇乙等等成分，大抵占有8%。2015 版《中國(guó)藥典》有實(shí)確規(guī)定，五味子藥材中蘊(yùn)含的五味子醇甲應(yīng)多于0.40%[2-3]中國(guó)藥典2015版一部五味子鑒別項(xiàng)下中采用藥材經(jīng)三氯甲烷提取后蒸干，加三氯甲烷溶解，作為供試品進(jìn)行鑒別，許多文獻(xiàn)方法也與藥典相同,也有直接用甲醇或乙酸乙酯超聲提取[4-11]進(jìn)行鑒別的。在本試驗(yàn)中，由于本品是經(jīng)過水煎煮提取的，故在供試品溶液制備方法選擇上采用甲醇提取后蒸干，殘?jiān)铀芙猓萌燃淄檩腿『笳舾?，用甲醇溶解做成供試品溶液，進(jìn)行鑒別，依據(jù)此法操作可除去大部分雜質(zhì)，所制備的供試品溶液不粘稠，易于點(diǎn)樣。擇選展開劑過程中，除去用屬于2015 版中國(guó)藥典一部五味子鑒別項(xiàng)下的展開體系石油醚（30～60 ℃）—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1）以外，也相比照了石油醚（60～90 ℃）—乙酸乙酯—甲酸（15:4.5:0.5）和環(huán)己烷—甲酸—乙酸乙酯（5:0.05:3）的分離效果。結(jié)果藥典所用展開劑系統(tǒng)的分離效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越二者。多次實(shí)驗(yàn)表明，所應(yīng)用的薄層鑒別方法，斑點(diǎn)分離更清楚,重復(fù)性優(yōu),陰性無干擾,專屬性較強(qiáng)。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 專屬性試驗(yàn) 在已經(jīng)選定的色譜條件下，樣品中斯皮諾素色譜峰前后并無雜峰干擾，顯示基本基線已經(jīng)分離，結(jié)果為圖2。

圖2 五味棗仁顆粒高效液相色譜圖

3.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在查閱了斯皮諾素含量測(cè)定文獻(xiàn)[12-22]基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)比較了如下幾種色譜柱和流動(dòng)相分離效果：色譜柱：1）HICHROM C18（4.6 mm·250 mm·5 μm）。2）Agilent Zorbax（250 mm·4.6 mm·5 μm）。3）Waters symmetry（4.6 mm·250 mm·5 μm）。流動(dòng)相：1）乙腈—水（20:80）2）乙腈—水（18:82）3）乙腈-水（15:85）4）乙腈—水（16:84）5）乙腈（A）-水（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，88% B～81% B；10～16 min，81% B～80% B；16～22 min，80%B～0% B；22～30 min，0% B），結(jié)果表明，3 種色譜柱配合乙腈—水（16:84）流動(dòng)相，均能使樣品中斯皮諾素與其它組分達(dá)到很好分離（分離度＞1.5），其中最優(yōu)的HICHROM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和乙腈—水（16:84）組合，分離效果最好，保留時(shí)間適宜，故作為本試驗(yàn)的色譜條件。

3.2.3 耐用性試驗(yàn) 拿取批號(hào)同一的樣品五味棗仁顆粒，依照上述測(cè)定條件，考查在測(cè)定條件有細(xì)微的波動(dòng)時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果作用程度。實(shí)驗(yàn)首要考察由不同型號(hào)色譜柱及不等柱溫以及互異流動(dòng)相配比等因素變動(dòng)的條件下樣品五味棗仁顆粒中斯皮諾素含量的影響。

3.2.3.1 色譜柱 本實(shí)驗(yàn)采用HICHROM-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SYMMETRY-C18 的不同型號(hào)色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在樣品中測(cè)得斯皮諾素的含量依次是：0.577 8、0.577 4、0.576 6 mg/g，斯皮諾素的含量于不同型號(hào)柱及同一批樣品中并無顯著變化。

3.2.3.2 柱溫 順次在20 ℃、30 ℃、40 ℃柱溫的條件量測(cè)樣品中斯皮諾素含量依次是：0.569 9、0.579 7、0.574 6 mg/g，結(jié)果：等批次樣品不同柱溫斯皮諾素含量無突出改變。

3.2.3.3 流動(dòng)相 選擇乙腈—水（15:85）、乙腈—水（16:84）、乙腈—水（17:83）三個(gè)比例的流動(dòng)相進(jìn)行觀察，結(jié)果斯皮諾素含量分別是0.573 4、0.580 7、0.582 4 mg/g。斯皮諾素含量在等批次不同流動(dòng)相配比下無突出改變。

4 結(jié)語(yǔ)

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在有輕微色譜條件改變時(shí)，斯皮諾素的含量在樣品中沒有明顯改變，產(chǎn)品薄層色譜鑒別和含量測(cè)定方式完美可行，重復(fù)性優(yōu)，此種方法擁具優(yōu)好的耐用性。