鮮竹瀝化學(xué)成分及抗炎活性研究

譚洋，劉良玉，游媛，姚金龍，林凱鵬，付輝政,，羅躍華*

1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥監(jiān)局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029；3.江西省藥品檢查員中心，南昌 330029

鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹Phyllostachys viridiglaucescens（Carr.）A.et C.Riv.、凈竹P.nudaMcClure、毛竹P.edulis（Carr.）J.Houz.及其同屬植物的新鮮桿莖經(jīng)加熱后自然瀝出的液體，煮沸加入適量防腐劑即得，其亦可稱(chēng)為竹油、竹醋液和竹汁［1,2］。具有清熱化痰的功效，臨床上用于治療肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶、小兒痰熱驚風(fēng)等病癥?！侗静菅芰x》稱(chēng)之為“痰家之圣劑”。其主要含有愈創(chuàng)木酚、氨基酸、無(wú)機(jī)元素、酚酸、黃酮、糖類(lèi)等成分［3-5］。目前，鮮竹瀝執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為1992年版《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第一冊(cè)，該標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的檢測(cè)項(xiàng)目包括性狀、薄層鑒別和3個(gè)理化檢查項(xiàng)［1］，標(biāo)準(zhǔn)較低，加之其加工工藝參數(shù)不明確，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，鮮竹瀝也是2019年度國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高起草品種。然而，目前對(duì)于鮮竹瀝藥效物質(zhì)研究報(bào)道較少，已報(bào)道的化學(xué)成分主要是通過(guò)理化分析確定的大類(lèi)成分，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)志物尚不明確，為了制定更加科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及充分挖掘該資源，作者在項(xiàng)目組前期化學(xué)成分研究基礎(chǔ)上［6,7］，繼續(xù)利用各種色譜、波譜技術(shù)從鮮竹瀝乙酸乙酯部位中分離鑒定了4個(gè)化合物，分別為1、（7S,8S）-5'-甲氧基-2,3,4,9-四羥基-3':7,4':8-二環(huán)氧新木脂素-1'-羧酸甲酯；2、紫菀苷A；3、（+）-ovafolinin B-9′-O-β-D-glucopyranoside；4、苯丙酮 4′-O-茜黃櫻草糖甙。其中化合物1是新化合物，化合物2～4是首次從鮮竹瀝中分離得到的化合物；體外活性檢測(cè)表明，化合物1具有抗炎活性，能劑量依賴(lài)性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α 和IL-6的釋放。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津20-AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；島津20-AR型半制備色譜儀（日本島津公司）；Buchi中壓制備色譜儀（瑞士Buchi公司）；EYELA SB-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；UV-260紫外分光光度儀（日本島津公司）；WZZZB旋光儀（上海物理光學(xué)儀器廠(chǎng)）；XT5B熔點(diǎn)儀（天津天光光學(xué)儀器有限公司）；Bruker DRX-400超導(dǎo)核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q TOF高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）；多功能微孔板檢測(cè)儀（BIOTEK，型號(hào)：synergy2）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，型號(hào)：Series 8000DH）。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑水為Milli-Q超純水，CD3OD和DMSO-d6為美國(guó)劍橋公司產(chǎn)品，色譜用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。毛竹采自江西銅鼓，經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院余林博士鑒定為禾本科剛竹屬植物毛竹P.edulis（Carr.）J.Houz.的新鮮桿莖。標(biāo)本現(xiàn)存放在江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥標(biāo)本館。C18填料為日本YMC產(chǎn)品，制備色譜柱為YMC（5 μm，250 mm×20 mm）；柱層層析硅膠、薄層硅膠G板（青島海洋化工廠(chǎng)）；RAW264.7細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；LPS試劑（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（Gibco公司，批號(hào)：2129075RP）；DMED高糖培養(yǎng)基（Cytiva公司，批號(hào)：AF29561079）；NO測(cè)試盒（碧云天生物研究所，批號(hào)：042318180614）；TNF-α（批號(hào)：8G319X）和IL-6 ELISA（批號(hào)：8G319X）試劑盒為武漢Elabscience公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取和制備方法取新鮮毛竹桿莖（10 t），經(jīng)切斷、開(kāi)片、加熱干餾、收集等多種工藝得到鮮竹瀝原液，鮮竹瀝原液經(jīng)低溫減壓濃縮至相對(duì)密度為1.21，得到鮮竹瀝浸膏。取浸膏，依次用乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行提取，每種溶劑各提取4次，合并每種溶劑提取液。再進(jìn)一步對(duì)得到的溶劑提取液進(jìn)行低溫減壓濃縮，得到乙酸乙酯干膏305 g和正丁醇干膏852 g。將乙酸乙酯干膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（10∶1～6∶4）進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜檢視合并得到9個(gè)組分Fr.1～Fr.9。Fr.1（111.9 g）通過(guò)硅膠柱分離，以氯仿-甲醇（80∶1～20∶1）梯度洗脫，薄層色譜檢視合并得11個(gè)組分Fr.1-1～Fr.1-11。Fr.1-9（3.3 g）再經(jīng)過(guò)中壓液相制備色譜，以甲醇-水（20∶80～60∶40）梯度洗脫，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)合并得到12個(gè)組分Fr.1-9-1～Fr.1-9-12。Fr.1-9-2（68.8 mg）經(jīng)反相半制備液相色譜，甲醇-0.02%三氟乙酸（30∶70）（7 mL/min）為流動(dòng)相，得化合物1（40.6 mg，tR=85.2 min）。Fr.1-9-4（35.2 mg）經(jīng)反相半制備液相色譜，以甲醇-水（25∶78）（7 mL/min）為流動(dòng)相，得到化合物2（7.5 mg，tR=92.3 min）、3（9.7 mg，tR=110.8 min）和4（4.1 mg，tR=123.4 min）。

2.2 體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)方法將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞（細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL）接種于24孔板中，每孔500 μL，于培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄上清液，試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組和鮮竹瀝A給藥組。每組6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組和模型組均加入10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基，給藥組分別加入藥物終濃度為0.1、1、10 μmol/L的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，模型組和給藥組分別加入終濃度為2 μg/mL的LPS溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，吸取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清中NO的含量，平行試驗(yàn)重復(fù)3次。

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞（細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL）接種于24孔板中，每孔500 μL，于培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄上清液，試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組和鮮竹瀝A給藥組。每組6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組和模型組均加入無(wú)血清培養(yǎng)基，給藥組分別加入藥物終濃度為0.1、1、10 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，模型組和給藥組分別加入終濃度為2 μg/mL的LPS溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，吸取上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)上清中TNF-α 和IL-6含量，平行試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 化學(xué)成分鑒定化合物1：白色粉末。mp 166～167 ℃；。紫外光譜（UV）數(shù)據(jù)表明該化合物在甲醇溶液中于279 nm處有最大吸收。紅外光譜（IR）顯示有羥基（3 319 cm-1）和苯環(huán)（1 448 cm-1）的吸收。HR-ESI-Q-TOF-MS質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰（m/z）：401.121 4［M+Na］+（計(jì)算值為401.120 7），分子式為C18H18O9。

1H-NMR譜中，顯示了一組AB鄰位偶合系統(tǒng)苯環(huán)質(zhì)子信號(hào)δH：7.24（1H，d，J=8.4 Hz），6.73（1H，d，J=8.4 Hz）；一組間位偶合苯環(huán)質(zhì)子信號(hào)δH：7.34 （2H，brd）；兩個(gè)甲氧基信號(hào)δH：3.89（6H，s）；此外，根據(jù)TCOSY譜，1H-NMR譜還顯示一組脂肪族質(zhì)子信號(hào)δH：5.00（1H，d，J=6.6 Hz），4.27（1H，m），3.76（1H，dd，J=12.0，3.6 Hz）和3.65（1H，overlap）。13C-NMR譜中，給出了18個(gè)碳信號(hào)，其中1個(gè)酯羰基碳信號(hào)δC：168.2；12個(gè)苯環(huán)碳信號(hào)δC：158.2，154.3，142.1，132.7，129.4，126.8，116.0，108.3，108.2；3個(gè)與氧連接的碳信號(hào)δC：89.0，74.3，62.1；2個(gè)甲氧基碳信號(hào)δC：56.9，52.9。通過(guò)以上數(shù)據(jù)可以推測(cè)化合物1為木脂素類(lèi)化合物，與文獻(xiàn)［8］所報(bào)道的3-（4-Hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-hydroxymethyl-8-methoxy-2,3-dihydrobenzo［1,4］oxine-6-carbaldehyde結(jié)構(gòu)比較，多一個(gè)羥基，醛基由羧基甲酯代替。

在HMBC中（圖1），H-2' （δH7.34）和H-6' （δH7.34）與羰基碳（δC168.2）相關(guān)，表明羰基碳連接在C-1' 位。OMe-5'（δH3.89）與C-5'（δC154.3）和OMe-7' （δH3.89）與C-7'（δC168.2）相關(guān)聯(lián)，說(shuō)明2個(gè)甲氧基分別位于C-5'和C-7'位。另外，H-7（δH5.00）與C-1（δC129.4），C-2（δC158.2），C-6（δC129.4），C-8（δC89.0）相關(guān)，表明C-7與C-1相連。

根據(jù)H-7和H-8的耦合常數(shù)JH-7,H-8=6.6 Hz，推測(cè)H-7和H-8的相對(duì)構(gòu)型為反式［9］。在NOESY譜中，H-7與H-9相關(guān)，而H-7與H-8無(wú)關(guān)聯(lián)，說(shuō)明H-7和H-8所處的位置為反式。在CD譜中，217 nm處可見(jiàn)正Cotton效應(yīng)（Δε217nm=+9.5），273 nm處顯示負(fù)Cotton效應(yīng)（Δε273nm=-7.5），由此確定該化合物7,8位的絕對(duì)構(gòu)型為7S，8S［10］。

綜上所述，化合物1結(jié)構(gòu)鑒定為（7S，8S）-5'-甲氧基-2，3，4，9-四羥基-3':7，4':8-二環(huán)氧新木脂素-1'-羧酸甲酯，結(jié)構(gòu)如圖1所示。具體核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 化合物1的1H-NMR and 13C-NMR波譜數(shù)據(jù)（600/150 MHz，CD3OD）

（續(xù)表）

化合物2：淡黃色粉末（甲醇）。HR-ESI-MS（m/z）：453 ［M+Na］+，429 ［M -H］-，1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：2.51（3H，s，H-8），4.16（1H，d，J=8.0 Hz，木糖-H-1″），4.93（1H，d，J=8.0 Hz，葡萄糖-H-1′），7.17（2H，d，J=8.6 Hz，H-3,5），7.94（2H，d，J=8.6 Hz，H-2,6）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：130.7（C-1），130.0（C-2，6），116.1（C-3，5），161.1（C-4），199.0（C-7），30.9（C-8），99.8（C-1′），73.0（C-2′），76.4（C-3′），69.3（C-4′），76.1（C-5′），68.2（C-6′），103.9（C-1″），73.0（C-2″），76.1（C-3″），69.5（C-4″），65.6（C-5″）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本吻合，所以鑒定化合物2為紫菀苷A。

化合物3：淡黃色粉末（甲醇）。HR-ESI-MS（m/z）：602 ［M+Na］+，578［M -H］-，1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.35（1H，d，J=7.6 Hz，H-8′），2.41（1H，m，H-8），2.93（1H，d，J=16.7 Hz，H-7′b），3.13（1H，dd，J=16.8，7.6 Hz，H-7′a），3.31（3H，s，3′-OMe），3.71（3H，s，4-OMe），3.70（1H，dd，J=11.2，6.0Hz，H-9b），3.78（3H，s，5′-OMe），3.87（1H，m，H-9′b），3.89（3H，s，2-OMe），3.98（1H，d，J=8.7 Hz，H-9a），4.33（1H，d，J=8.0 Hz，Glc-H-1″），4.46（2H，dd，J=11.8，4.2 Hz，H-9′a），4.79（1H，s，H-7），6.33（1H，s，H-5），6.54（1H，s，H-6′）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：125.7（C-1），146.9（C-2），136.8（C-3），147.8（C-4），102.4（C-5），154.1（C-6），31.5（C-7），42.4（C-8），73.6（C-9），127.5（C-1′），124.2 （C-2′），147.5（C-3′），138.4（C-4′），148.6（C-5′），107.5（C-6′），30.3（C-7′），35.7（C-8′），81.5（C-9′），104.8（C-1″），75.5（C-2″），78.2（C-3″），71.4（C-4″），77.8（C-5″），62.5（C-6″），62.1（3-OCH3），56.6（4-OCH3），60.1（3′-OCH3），56.5（3′-OCH3）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本吻合，所以鑒定化合物3為（+）-ovafolinin B-9′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物4：棕色粉末（甲醇）。HR-ESI-MSm/z：467 ［M+Na］+，443 ［M-H］-，1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.19（3H，t，J=7.8 Hz，H-9），3.04（2H，m，H-8），3.76（1H，m，H-6'b），4.11（1H，dd，J=12.0，2.0 Hz，H-6'a），4.33（1H，d，J=8.0 Hz，木糖-H-1''），4.98（1H，d，J=8.0 Hz，葡萄糖-H-1'），7.21（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），7.99（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：132.4（C-1），131.4（C-2），117.3（C-3），162.7（C-4），117.3（C-5），131.4（C-6），202.1（C-7），32.4（C-8），8.7（C-9），101.5（C-1′），74.8（C-2′），77.7（C-3′），71.4（C-4′），77.8（C-5′），69.8（C-6′），105.4（C-1″），75.1（C-2″），77.9（C-3″），71.3（C-4″），66.8（C-5″）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本吻合，所以鑒定化合物4為苯丙酮 4′-O-茜黃櫻草糖甙。

2.4 抗炎活性藥理活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，LPS顯著增加RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α和IL-6的釋放，均具有顯著性差異（P＜0.001）（見(jiàn)表2）。化合物1能劑量依賴(lài)性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α 和IL-6的釋放；其他化合物均無(wú)顯著的抗炎活性。

表2 化合物1對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響（，n=6）

表2 化合物1對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響（，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05、##P＜0.01，###P＜0.001。

3 討論

鮮竹瀝是具有傳統(tǒng)工藝炮制（火炙法）特色的一味止咳祛痰中藥，療效確切。本課題組對(duì)鮮竹瀝化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)性研究，首次從鮮竹瀝中獲得2個(gè)木質(zhì)素類(lèi)化合物和2個(gè)酚糖苷類(lèi)化合物，其中化合物1為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物，且具有良好的抗炎活性，能劑量依賴(lài)性地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α 和IL-6的釋放，為闡明鮮竹瀝鎮(zhèn)咳祛痰藥效奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)為鮮竹瀝進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。