菲律賓蛤仔不同組分中重金屬存在形態(tài)研究

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(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023; 2.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,浙江杭州 310016)

菲律賓蛤仔是沿海主要養(yǎng)殖的海產(chǎn)貝類之一[1],味道鮮美且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,氨基酸的類別組成及含量比例合理[2]，含有各類維生素及藥用成分以及人體必需的多種微量元素,因此備受青睞。但其因?yàn)V食性、活動(dòng)性差等生活特點(diǎn)易受到如重金屬等污染物的污染[3],重金屬超標(biāo)的貝類產(chǎn)品不僅會(huì)威脅人們的身體健康,還會(huì)影響產(chǎn)品的出口貿(mào)易制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展。金屬元素不僅可以溶解狀態(tài)存在,還會(huì)以顆粒態(tài)形式存在[4]。顆粒態(tài)重金屬的形成過程是重金屬與有機(jī)配位基和形成絡(luò)合物的電子供體相結(jié)合,因此呈現(xiàn)多種形態(tài),相關(guān)研究表明,金屬元素在食品中存在形態(tài)對(duì)生物吸收利用率產(chǎn)生關(guān)鍵影響[5]。不同的存在形態(tài)會(huì)極大地影響其生物的吸收、利用及體內(nèi)分布,造成不同的生物效應(yīng)或產(chǎn)生生理毒害作用[6]。不同存在形態(tài)的顆粒態(tài)重金屬的結(jié)合強(qiáng)度差異較大,因此導(dǎo)致生物效應(yīng)不同,穩(wěn)定性強(qiáng)弱依次為可交換態(tài)>硫化物結(jié)合態(tài)>結(jié)合態(tài)>殘?jiān)鼞B(tài)[7]?？山粨Q態(tài)金屬對(duì)環(huán)境的變化最為敏感,且最易被生物體吸收,硫化物結(jié)合態(tài)是酸可提取態(tài),可交換態(tài)金屬和硫化物結(jié)合態(tài)屬于相對(duì)易可給態(tài)重金屬;有機(jī)物結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)對(duì)環(huán)境變化不敏感,不易被生物吸收,均屬于惰性態(tài)重金屬,且殘?jiān)鼞B(tài)對(duì)生物無效應(yīng)[8]。

近年來有關(guān)形態(tài)分析的報(bào)道逐漸增多,如Brezonik等[9]及Foerstner等[10]都對(duì)形態(tài)分析作了專題討論。逐級(jí)化學(xué)提取法(SCEE)又稱逐級(jí)提取或連續(xù)提取,可將復(fù)雜體系中不同存在形態(tài)的顆粒態(tài)重金屬提取出來,便于之后的分析討論[11]。此方法基于Tessier五步連續(xù)提取法,根據(jù)研究土壤中微量元素存在狀態(tài)的方法進(jìn)行改進(jìn)而發(fā)展起來[12],在定量研究重金屬元素存在狀態(tài)的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)不同形態(tài)元素的溶解度在溶劑中交換強(qiáng)度的差異,將樣品中的顆粒態(tài)重金屬依次提取到目標(biāo)溶液中[13]。選擇合適的重金屬元素提取劑,依次提取可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)物結(jié)合態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)(形態(tài)劃分由Siebielec等[14]確立)。提取的各種形態(tài)之和應(yīng)該等于元素的總量[15],所以可由回收率對(duì)方法的可行性進(jìn)行檢測(cè),但是由于城市空氣中存在重金屬的懸浮物,可能會(huì)造成提取的一部分重金屬并不全來源于樣品中,所以此方法也存在一定的誤差[16]。許多學(xué)者對(duì)菲律賓蛤仔和牡蠣中的金屬進(jìn)行了深入研究,呂永紅[17]的研究證實(shí)了各種濃度的鎘離子對(duì)菲律賓蛤仔呼吸過程均具有較顯著的抑制作用;孟慧等[18]研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牡蠣中鋅的主要存在形態(tài)是無機(jī)態(tài),且有少量以有機(jī)結(jié)合態(tài)形式存在;蔡立哲等[19]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菲律賓蛤仔的鰓和軟體部位的鉛、鋅含量與實(shí)驗(yàn)水體中的鉛、鋅濃度成正比,但鰓對(duì)鉛、鋅的積累量較高。仇紅萍[20]對(duì)牡蠣的研究中發(fā)現(xiàn)牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中的鎘元素超出國(guó)家食品衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)范圍。

本文將逐級(jí)化學(xué)提取技術(shù)應(yīng)用到菲律賓蛤仔中重金屬元素的形態(tài)研究上,并驗(yàn)證其可行性。實(shí)驗(yàn)以鉛、鋅、鎘三種重金屬為例研究菲律賓蛤仔中重金屬元素分布及存在形態(tài),將新鮮的菲律賓蛤仔通過差速離心制備成細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體三種組分,分別測(cè)定這三種組分的鉛、鎘、鋅重金屬含量及存在形態(tài),根據(jù)重金屬含量的測(cè)定結(jié)果得出重金屬在細(xì)胞中的分布及存在形態(tài)特點(diǎn),可為以后評(píng)估貝類中的重金屬毒性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的菲律賓蛤仔 體長(zhǎng)2～3 cm,采購(gòu)于大連長(zhǎng)興市場(chǎng);氯化鈉、濃硝酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠;鉛、鋅、鎘重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液 單標(biāo),國(guó)家有色重金屬及電子材料分析測(cè)試中心;氯化鎂、30%過氧化氫 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;超純水 實(shí)驗(yàn)室自制。

FD-1型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;FW高速萬能粉碎機(jī)、可調(diào)試電陶爐 天津市泰斯特儀器有限公司;GZX-GF型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;KQ-C玻璃儀器氣流烘干器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;Optima 8000 ICP原子發(fā)射光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司;Milli-Q超純水儀 法國(guó)Millipore;AR224CN型電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘怡實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;PB-10酸度計(jì) Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組分制備 將采購(gòu)的新鮮菲律賓蛤仔先用過濾海水沖凈其表面的淤泥、臟雜物等附著物,選擇殼體無破損、正?；顒?dòng)、大小基本一致的蛤仔放入冰柜冷凍,次日取出,稱取1.5 kg,于室溫稍微解凍后除去外殼,用大張濾紙吸干蛤肉上多余的水分,保留整體蛤肉并稱重,之后將蛤肉剪碎,加入兩倍蛤肉體積的0.75%氯化鈉溶液,用均質(zhì)機(jī)粉碎,粉碎得到的原液進(jìn)行差速離心,以轉(zhuǎn)速2000×g離心10 min,沉淀物即為細(xì)胞核組分,將上清液繼續(xù)以10000×g的離心10 min,上清液即為細(xì)胞質(zhì)組分,沉淀物為線粒體組分,凍干并打粉,于-20 ℃干燥條件下存儲(chǔ)。

1.2.2 重金屬含量測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(儲(chǔ)備液):取1個(gè)已泡酸的容量瓶(100 mL),按表1加入重金屬標(biāo)準(zhǔn)液,用HNO3(0.5%)定容,搖勻備用。

表1 金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(儲(chǔ)備液)配制方法Table 1 Preparation method of metal standard solution(stock solution)

重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(工作液):取7個(gè)已泡酸的50 mL石英瓶,分別加入0、1.0、5.0、10.0、18.0、25.0、35.0 mL重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(儲(chǔ)備液),用0.5%硝酸定容至刻度,搖勻備用。將定容好的重金屬標(biāo)準(zhǔn)液(工作液)用原子發(fā)射光譜儀按濃度從低到高依次進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)測(cè)得的強(qiáng)度值與工作液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品濕法消化 準(zhǔn)確稱取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體各0.2 g,分別加入10 mL優(yōu)級(jí)純硝酸于50 mL已泡酸過夜的石英瓶中,于200～300 ℃加熱板上加熱消化2～3 h,若未完全消化或酸液過少,則需補(bǔ)加幾毫升硝酸繼續(xù)消化,直至變成透明無色,冷卻后用超純水定容于100 mL的容量瓶?jī)?nèi)[21],同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3 樣品重金屬含量測(cè)定 檢測(cè)條件為:等離子體氣流量20 L/min;輔助氣流量0.3 L/min;霧化器氣體流量0.24 L/min;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速:1.0 mL/min。Pb、Zn、Cd這3種重金屬元素的檢測(cè)波長(zhǎng)分別是:220.35、206.20、228.80 nm。

將樣品消化液用0.45 μm過濾器過濾,并稀釋10倍,進(jìn)樣前先用0.5%硝酸沖洗系統(tǒng)3～5 min,先對(duì)空白樣進(jìn)行測(cè)定。每進(jìn)一組平行待測(cè)樣沖洗一次,每次沖洗2 min,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。測(cè)定結(jié)束先用5%硝酸沖洗10 min,再用超純水沖洗10 min,最后將進(jìn)樣孔暴露于空氣中使整個(gè)系統(tǒng)將液體排空。

1.2.2.4 重金屬含量計(jì)算 用原子發(fā)射光譜儀測(cè)出的數(shù)據(jù)為強(qiáng)度,將強(qiáng)度代入標(biāo)曲求出X值。

重金屬含量(mg/g)=X×V×A/M

式中：V-容量瓶體積(mL);A-稀釋倍數(shù);M-樣品重量(g);X-溶液濃度值(mg/mL)。

1.2.2.5 可交換態(tài)重金屬的提取 準(zhǔn)確稱取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體各0.1 g,每個(gè)樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)分別加入15 mL 1 mol/L MgCl2溶液,在室溫下振蕩4 h,以 4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶?jī)?nèi)[22]。

1.2.2.6 硫化物結(jié)合態(tài)重金屬的提取 將離心所得沉淀物分別用10 mL超純水漂洗,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,棄掉上清液,取殘余物分別添加15 mL HNO3溶液,置于100 ℃水浴中加熱30 min,間歇振蕩,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.7 有機(jī)物結(jié)合態(tài)重金屬的提取 硫化物結(jié)合態(tài)獲得的沉淀物各用10 mL超純水漂洗,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,將上清液棄掉,取殘余物分別加10 mL超純水,以稀硝酸調(diào)節(jié)溶液pH至2.0,加入5 mL 30%的H2O2,置于80～85 ℃水浴中加熱約5 h,間歇振蕩,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.8 殘?jiān)鼞B(tài)重金屬的提取 有機(jī)物結(jié)合態(tài)得到的殘余物分別用10 mL超純水漂洗,離心,將上清液棄掉,取殘余物。加入10 mL優(yōu)級(jí)純硝酸于50 mL已泡酸過夜的石英瓶中,于200～300 ℃加熱板上加熱消化2～3 h,若未完全消化或酸液過少,則需補(bǔ)加幾毫升酸液繼續(xù)消化,直至變成透明無色,冷卻后用超純水定容于50 mL的容量瓶?jī)?nèi),用封口膜纏繞放入冰箱中冷藏。取與消化樣相同量的酸液,按上述步驟做空白試驗(yàn)[23]。

1.2.2.9 各存在形態(tài)金屬含量及回收率測(cè)定 采用原子發(fā)射光譜法[24]測(cè)定提取后各存在形態(tài)金屬元素的發(fā)射光強(qiáng)度,由工作曲線算出相應(yīng)的含量[25],具體操作方法同1.2.2.3樣品重金屬含量測(cè)定。

各種重金屬回收率計(jì)算公式如下:

回收率(%)=重金屬各存在形態(tài)含量之和/重金屬總量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定三次,測(cè)定結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析與作圖計(jì)算各形態(tài)在各組分的占比情況,用原子發(fā)射光譜儀測(cè)出的數(shù)據(jù)為強(qiáng)度,將強(qiáng)度值代入標(biāo)曲求出X值,即為各形態(tài)在各組分的含量,并計(jì)算相應(yīng)百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級(jí)離心制備細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)組分

1.5 kg菲律賓蛤仔得到貝肉重量約為500 g,經(jīng)過分級(jí)離心所得到的細(xì)胞核組分凍干粉質(zhì)量為43.77 g,占比約為46.37%;線粒體組分凍干粉質(zhì)量為16.08 g,占比約為17.03%;細(xì)胞質(zhì)組分凍干粉質(zhì)量為34.55 g,占比約為36.60%;其中細(xì)胞核組分含量最高,線粒體組分含量最低。

2.2 重金屬在各組分中的含量、回收率及存在形態(tài)

2.2.1 重金屬在各組分中的含量

2.2.1.1 鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:鉛含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=25649x+1568.8,標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為R2=0.9924。

圖1 金屬鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for metallic plumbum

2.2.1.2 鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:鋅含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=285405x-12153,標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為R2=0.9919。

圖2 金屬鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for metallic zinc

2.2.1.3 鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:鎘含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=289025x-5159.7,標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為R2=0.9968。

圖3 金屬鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of metallic cadmium

2.2.1.4 重金屬在各組分中的含量計(jì)算 三種金屬在三種組分中的含量測(cè)定結(jié)果如表2所示,鉛和鎘在細(xì)胞質(zhì)中含量最高,鋅主要存在于細(xì)胞核和線粒體中。在各組分中,鋅含量均為最高，菲律賓蛤仔是一種富鋅食物。鋅是人體的必需微量元素,每天攝入10～20 mg是對(duì)人體有益的，但是當(dāng)人體每天攝入鋅含量超過40 mg以上,對(duì)人體有一定的毒性。與鋅元素不同,鉛和鎘是有毒重金屬,由于樣品含量以干重計(jì)算,鉛和鎘元素含量相對(duì)生鮮貝類較高。

表2 重金屬在各組分中的含量(干重,mg/g)Table 2 Contents of heavy metal in each component(dry weight,mg/g)

2.2.2 鉛在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)分析 如圖4所示,在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)這三種組分中重金屬鉛主要以硫化物結(jié)合態(tài)存在,所占的比例分別為75.24%、50.71%和71.29%,其余三種形態(tài)均未檢出,說明逐級(jí)化學(xué)提取技術(shù)對(duì)貝類中鉛元素存在形態(tài)檢測(cè)的回收率不高。硫化物結(jié)合態(tài)是一種易于提取的元素狀態(tài)，雖然不如可交換態(tài)易于入環(huán)境,但比有機(jī)物結(jié)合態(tài)活潑,在一定條件下容易釋放出來的。所以菲律賓蛤仔各組分中的鉛元素相對(duì)易于進(jìn)入環(huán)境,易被人體吸收。

圖4 鉛在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)Fig.4 Different forms of metallic plumbum in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.3 鋅在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)分析 如圖5所示,菲律賓蛤仔中的重金屬鋅在四種形態(tài)中都存在,其中,在細(xì)胞核中鋅的殘?jiān)鼞B(tài)含量最高為34.51%,殘?jiān)鼞B(tài)重金屬在自然條件下釋放的可能性極小,能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在,不易被生物體富集,說明在細(xì)胞核鋅元素大部分比較穩(wěn)定[26]。線粒體中鋅的可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)含量相近。細(xì)胞質(zhì)中鋅主要以可交換態(tài)存在,所占比例為35.21%,而交換態(tài)是最易被生物體吸收利用的形態(tài),由于生物可利用態(tài)的含量最高,所以在細(xì)胞質(zhì)中鋅元素大部分比較活躍[27]。說明鋅元素在菲律賓蛤仔各組分中存在形態(tài)相差較大,細(xì)胞核中主要以穩(wěn)定的殘?jiān)鼞B(tài)存在,在細(xì)胞質(zhì)中以活潑的可交換態(tài)存在。

圖5 鋅在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)Fig.5 Different forms of metallic zinc in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.4 鎘在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)分析 如圖6所示,菲律賓蛤仔中的重金屬鎘主要以可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)和有機(jī)物結(jié)合態(tài)這三種可利用態(tài)金屬的形態(tài)存在,基本沒有以殘?jiān)鼞B(tài)存在的鎘元素,因?yàn)闅堅(jiān)鼞B(tài)是最穩(wěn)定的金屬存在形態(tài),也叫穩(wěn)定態(tài)[28],所以菲律賓蛤仔各細(xì)胞器組分中的重金屬鎘沒有最穩(wěn)定的穩(wěn)定態(tài)。其中鎘在細(xì)胞核和線粒體中的形態(tài)分布相同,有機(jī)物結(jié)合態(tài)所占比例最高分別為43.03%和40.74%,其次是硫化物結(jié)合態(tài),所占比例分別為32.07%和31.57%,可交換態(tài)含量較少,分別為23.98%和20.73%。鎘在細(xì)胞質(zhì)中存在形態(tài)的分布與細(xì)胞核和線粒體中的不同,可交換態(tài)含量最高,所占比例為47.38%,說明細(xì)胞質(zhì)中的鎘元素更易釋放到環(huán)境中。

圖6 鎘在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的存在形態(tài)Fig.6 Different forms of metallic cadmium in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

從菲律賓蛤仔各組分重金屬存在形態(tài)來看,在細(xì)胞核和線粒體中,鋅和鎘主要以有機(jī)物結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)存在,較穩(wěn)定,不易釋放;在細(xì)胞質(zhì)中,鉛、鋅和鎘主要以可交換態(tài)和硫化物結(jié)合態(tài)形式存在,易于釋放到環(huán)境中,易于被人體吸收。

2.2.5 逐級(jí)化學(xué)提取法提取重金屬元素回收率 由表3可知,不同重金屬元素在不同組分中回收率不一樣,重金屬元素在不同組分中回收率為50.71%～99.18%。其中Cd回收率最高,回收率為93.04%～99.18%。說明采用逐級(jí)化學(xué)提取法分析菲律賓蛤仔組分中重金屬存在形態(tài)是可行的。

表3 重金屬元素回收率(%)Table 3 Recovery rate of heavy metal element(%)

3 結(jié)論

綜上所述,通過差速離心得到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體三種組分,采用原子發(fā)射光譜法分析研究三種組分中鉛、鋅、鎘三種重金屬含量及金屬存在形態(tài)。結(jié)果表明,采用逐級(jí)化學(xué)提取法分析菲律賓蛤仔細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)三種組分中重金屬鉛、鋅、鎘是可行的。菲律賓蛤仔中的重金屬鉛主要以硫化物結(jié)合態(tài)存在,在一定條件下還是容易釋放到環(huán)境中;重金屬鋅在四種形態(tài)中都存在,其中鋅在細(xì)胞核中的殘?jiān)鼞B(tài)含量最高,細(xì)胞質(zhì)中鋅主要以可交換態(tài)存在;菲律賓蛤仔中的重金屬鎘主要以可交換態(tài)、硫化物結(jié)合態(tài)和有機(jī)物結(jié)合態(tài)這三種形態(tài)存在,基本沒有以殘?jiān)鼞B(tài)存在的鎘元素。綜上,菲律賓蛤仔細(xì)胞質(zhì)中鉛、鋅、鎘三種金屬易于釋放;細(xì)胞核、線粒體中鋅、鎘兩種元素相對(duì)穩(wěn)定。食品中的重金屬在與生物成分結(jié)合后,會(huì)形成多種形態(tài),造成毒性的改變,但在實(shí)際的人體代謝過程中,其形態(tài)是否改變,還有待進(jìn)一步研究。