兩株乳酸菌的發(fā)酵特性及在發(fā)酵驢肉腸中的應用

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(1.河北農業(yè)大學食品科技學院,河北保定 071001;2.承德市農產(chǎn)品加工服務中心,河北承德 067000;3.承德市農業(yè)農村局科教站,河北承德 067000)

肉類是我國飲食中的重要組成部分[1-2],驢肉營養(yǎng)豐富,古人將其喻為龍肉。研究顯示驢肉的蛋白質含量、多不飽和脂肪酸含量、礦物元素鐵(Fe)的含量高于人們日常食用的牛肉、豬肉、羊肉[3-4]。從營養(yǎng)學角度來看,驢肉的低脂肪、低膽固醇含量以及豐富的蛋白質含量,較高的膠原蛋白[5]是很理想的動物性食品。

發(fā)酵香腸,相較于未發(fā)酵的香腸,有著豐富的發(fā)酵滋味[6],彈性和咀嚼性均有顯著增大。發(fā)酵使香腸的pH降低[7],從而使蛋白質的結構發(fā)生變化[8-9]。這一過程改變了香腸的內部結構,香腸的持水力發(fā)生改變,從而使得香腸的結構更致密,同時提高了其貯藏性[10-11]。發(fā)酵菌種的選擇是影響發(fā)酵過程及發(fā)酵結果的重要因素,在李彩鳳等[12-13]的研究中,明確了在保證發(fā)酵安全性的前提下,還需要考察菌種對發(fā)酵環(huán)境(鹽濃度、硝酸鹽濃度等)的適應性。故將所選菌種進行了生長曲線和產(chǎn)酸的測定。周才瓊等[14-15]研究了自然發(fā)酵肉中存在的微生物,結果表明發(fā)酵肉中優(yōu)勢菌群主要是乳酸菌中的片球菌屬和乳桿菌屬,此類發(fā)酵微生物的增殖代謝活動直接影響酸肉風味的豐富性。Blom等[16]利用從干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,L.c)代謝產(chǎn)物中提取的蛋白酶加入到發(fā)酵香腸中,與添加發(fā)酵劑L.c的香腸做對比,產(chǎn)品風味基本無差別。戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus,P.p)在發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中,不僅會快速降低發(fā)酵香腸的pH,還會增加香腸的蛋白質含量,優(yōu)化香腸的口感,提升感官品質[17]。楊帆[18]的研究表明L.c在發(fā)酵肉中混合發(fā)酵可以使肉的pH快速降低,可以明顯的抑制腐胺的生成,提高了發(fā)酵香腸的安全性。

本研究對P.p和L.c兩種乳酸菌進行發(fā)酵試驗,將所選菌種進行了生長曲線和產(chǎn)酸的測定,對菌種是否具有耐鹽性、耐硝酸鹽進行了試驗,并探究了其能否作為混合發(fā)酵劑發(fā)酵驢肉香腸,然后以驢肉為發(fā)酵基料,研究發(fā)酵驢肉腸混合乳酸(LAB)發(fā)酵劑的菌液濃度、添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間,為進一步制作發(fā)酵驢肉腸提供更好的發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢肉(2～3歲健康粉驢,臥宰,選用符合衛(wèi)生檢疫要求并解僵完成的新鮮驢肉) 河北河間樸康源驢肉制品有限公司;復合磷酸鹽 河南隆霄生物科技有限公司;大豆分離蛋白(純度98%) 天津市光復精細化工研究所;干酪乳桿菌、戊糖片球菌 河北農業(yè)大學菌種保藏實驗室;乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS) 北京奧博星生物技術有限責任公司;瓊脂 索萊寶生物制劑有限公司;革蘭氏染色液試劑盒 北京陸橋試劑有限公司;其他配料(如馬鈴薯淀粉、五香粉等) 均為食品級;所用溶劑均為國產(chǎn)分析純。

MGB絞肉灌腸機 上海知信實驗儀器技術有限公司;UV-2800紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;BH2-UMA光學顯微鏡 OLYMPUS;STARTER3100精密pH計 上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵劑特性測定

1.2.1.1 菌種活化 接種針蘸取菌液后在MRS平板上劃線,35 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接入10 mL MRS液體培養(yǎng)基,35 ℃靜置培養(yǎng)24 h,取100 μL培養(yǎng)物用稀釋平板法測定發(fā)酵液活菌數(shù)(CFU/mL)。將測得發(fā)酵液菌液濃度稀釋至1×103CFU/mL后取100 μL接種于MRS培養(yǎng)液中35 ℃靜置培養(yǎng)24 h,用稀釋平板法測定發(fā)酵液活菌數(shù)(CFU/mL),待用[19-20]。

1.2.1.2 生長曲線的測定 將1.2.1.1中活化好的菌株以1%的接種量接入到MRS液體培養(yǎng)基中,于35 ℃培養(yǎng),同時以新鮮的培養(yǎng)基為空白對照,每隔2 h于紫外分光光度計下660 nm處測定OD值,平行測定三次,取平均值[21]。

1.2.1.3 產(chǎn)酸率的測定 將P.p和L.c分別接種于MRS培養(yǎng)基,菌液濃度均為1×103CFU/mL,接入量為1%,于35 ℃,培養(yǎng)24 h,然后測量出pH的變化,來觀察兩種菌的產(chǎn)酸情況。

1.2.1.4 耐鹽性的測定 在將活化好的菌株L.c和P.p按1%的接種量分別接入到添加不同含量(0%、2%、4%、6%)食鹽的MRS培養(yǎng)基中,在35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,然后于紫外分光光度計下660 nm處測定OD值的變化,來判斷兩種菌的生長情況。

1.2.1.5 耐亞硝酸鹽性的測定 用添加了不同梯度含量(0、50、100、150 mg/kg)亞硝酸鹽的MRS培養(yǎng)基,將已知菌液濃度的L.c和P.p菌液濃度稀釋至1×103CFU/mL后分別接種,接入量為1%于35 ℃培養(yǎng)24 h,然后于紫外分光光度計下660 nm處測定OD值的變化,來判斷兩種菌的生長情況。

1.2.1.6 相互作用 將活化好的菌種P.p和L.c以不同的混合比(10∶1、1∶1、1∶10)接入到MRS培養(yǎng)基中,接種量為1%,同時將P.p和L.c單獨接入MRS培養(yǎng)基為對照,將已知菌液濃度的L.c和P.p菌液濃度稀釋至1×103CFU/mL后分別接入P.p、L.c及P.p和L.c的混合菌(10∶1、1∶1、1∶10),接入量為1 mL(混合菌P.p和L.c各0.5mL)于35 ℃,培養(yǎng)48 h,然后測定其OD值和pH,來判斷兩種菌的生長情況。

1.2.2 發(fā)酵驢肉腸的制備

1.2.2.1 工藝流程

圖1 工藝流程Table 1 Technological process

1.2.2.2 基礎配方 瘦肉∶肥膘(9∶1),食鹽2%,葡萄糖1%,大豆分離蛋白1.5%,亞硝酸鈉0.01%,大蒜末0.1%,五香粉0.2%,味精0.05%,復合磷酸鹽0.2%,姜粉0.5%,蔗糖1%,淀粉8%,水10%,不同比例和濃度的發(fā)酵菌液。

1.2.2.3 操作要點 將驢后腿、臀部肥瘦肉分離,去除瘦肉中可見筋膜、脂肪,將處理好的瘦肉和肥膘分別過6 mm孔板絞碎;將食鹽、復合磷酸鹽拌勻,加入瘦肉、肥膘質量比9∶1的肉中,混勻攪拌后于-4 ℃條件下腌制24 h,再加入其他配料,注意配料添加過程中大豆分離蛋白需復水后再加入;接種用噴壺均勻淋在肉餡表面;肉餡混勻攪拌8 min后送入灌腸機中灌制,每節(jié)腸15 cm左右;發(fā)酵時間12 h,溫度在30～37 ℃度之間;烘烤溫度控制在(65±1) ℃,烘烤480 min,然后將其放入溫度為105 ℃的烤箱中焙烤10 min結束;將香腸自然冷卻至室溫后用經(jīng)過紫外殺菌15 min的真空袋進行真空包裝。

表2 發(fā)酵驢肉腸感官評分表Table 2 Sensory scoreTable of fermented donkey sausage

1.2.3 發(fā)酵驢肉腸發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 混合發(fā)酵劑不同菌種配比對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 發(fā)酵溫度選取35 ℃,發(fā)酵時間為24 h,發(fā)酵劑菌液濃度為1×106CFU/mL,發(fā)酵劑添加量為1%,將P.p和L.c發(fā)酵劑按照體積比為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4進行發(fā)酵試驗,探究不同菌種配比對發(fā)酵驢肉腸品質的影響。

1.2.3.2 混合發(fā)酵劑菌液濃度的對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 發(fā)酵溫度選取35 ℃,發(fā)酵時間為24 h,發(fā)酵劑添加量為1%,菌種配比為1.2.3.1的較適菌種配比,選取的發(fā)酵劑菌液濃度分別為1×103、104、105、106、107CFU/mL進行試驗,探究不同菌液濃度發(fā)酵對發(fā)酵驢肉腸品質的影響。

1.2.3.3 混合發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 選取1.2.3.1的較適菌種配比和1.2.3.2的菌液濃度,發(fā)酵溫度選取35 ℃,發(fā)酵時間為24 h,探究發(fā)酵劑添加量(質量分數(shù))1%、2%、3%、4%、5%、6%對發(fā)酵驢肉腸品質的影響。

1.2.3.4 混合發(fā)酵劑發(fā)酵溫度對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 選取1.2.3.1的較適菌種配比和1.2.3.2的菌液濃度和1.2.3.3的添加量,發(fā)酵時間為24 h,探究發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃對發(fā)酵驢肉腸品質的影響。

1.2.3.5 混合發(fā)酵劑發(fā)酵時長對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 發(fā)酵劑菌種配比、菌液濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵劑添加量分別選取上述較佳水平,探究發(fā)酵時間分別為14、16、18、20、22、24 h對發(fā)酵驢肉腸品質的影響。

1.2.3.6 正交試驗 根據(jù)以上單因素實驗結果,固定發(fā)酵劑比例為1∶1,采用L9(34)正交表,以產(chǎn)品的pH和感官評價為最終指標來篩選出最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)。正交試驗的因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal test

1.2.4 感官指標的測定

1.2.4.1 pH的測定 參考GB 5099.237[22]的方法。

1.2.4.2 感官評分 接受過食品感官評價培訓的研究生8名(4男4女)和2名老師組成感官評定小組,以形態(tài)、色澤、香氣和滋味為指標,為發(fā)酵驢肉腸進行評分。選擇下午三點進行評定試驗,每次試驗之前將發(fā)酵驢肉腸置于20 ℃培養(yǎng)箱中30 min。驢肉發(fā)酵腸感官評分表如下表2所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s法顯著性分析(P<0.05);用Microsoft Excel 2007軟件繪制圖表。重復測定3次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵劑特性測定

2.1.1 生長曲線 由圖2可以得出,兩種LAB的菌體密度隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大,L.c在2 h后進入對數(shù)生長期,菌體密度迅速增多,在培養(yǎng)14 h后進入了穩(wěn)定生長期,此時的菌體密度基本達到最大值,是菌體的最佳收獲期。P.p在培養(yǎng)4 h后進入對數(shù)生長期,經(jīng)過菌體數(shù)量快速累積后于16 h進入穩(wěn)定生長期。P.p和L.c在肉湯培養(yǎng)過程中均經(jīng)歷了短暫的延滯期后開始指數(shù)式增長,這樣有利于其在發(fā)酵過程中快速適應發(fā)酵環(huán)境,迅速發(fā)展成為優(yōu)勢菌群進行代謝產(chǎn)酸,抑制了其他雜菌或者有害菌的生長,保證發(fā)酵食品的安全性。又因為代謝作用形成代謝產(chǎn)物的累積以及原有成分的分解,賦予了制品特殊的發(fā)酵風味。

圖2 兩種LAB的生長曲線Fig.2 Growth curve during of two kinds of LAB

2.1.2 產(chǎn)酸率 乳酸菌分解營養(yǎng)物質產(chǎn)酸[23],由表3可以看出P.p在剛開始的4 h內pH下降緩慢,在4～16 h之間，pH由5.94下降到了4.62以下,在16 h之后pH緩慢的降低,L.c在最初的4 h內pH變化相較4～16 h不明顯,在4～16 h內變化顯著,pH迅速降低,而在16 h之后,變化不顯著。此結果與Baka等結果一致[24-25],pH下降菌體處于延滯期時pH下降緩慢,在對數(shù)期內pH迅速下降,pH的變化情況和菌體生長情況趨勢一致。由于菌體在此階段快速生長,代謝速率加快,大量利用營養(yǎng)物質導致產(chǎn)酸顯著增加,pH急速降低,當菌體的生長進入穩(wěn)定生長期后,pH下降緩慢,此結果與樊明明等[26]的對發(fā)酵微生物產(chǎn)酸研究結果一致,由于微生物增殖代謝過程中消耗大量的營養(yǎng)物質且有某些代謝產(chǎn)物的累積,改變了其環(huán)境組成,不利于LAB進行大量增殖產(chǎn)酸活動的進行。

表3 兩種LAB的pH變化Table 3 Changes on pH value of two kinds of LAB

注:同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);表4、表5同。

2.1.3 耐鹽性 由表4可知,P.p和L.c在0到6%的食鹽含量中均可進行生長代謝,但每個梯度的吸光值有明顯的降低,L.c在2%的食鹽添加量下OD值下降了1%,在4%的食鹽添加量下OD值下降了3%,在6%的食鹽添加量下OD值下降了11%,不同添加量下的差異均極顯著(P<0.01)。P.p在不同的食鹽濃度梯度下,OD值也處于下降的趨勢,在6%水平下OD值下降了16%,且在不同添加量食鹽條件下,P.p的菌液濃度有極顯著的差異(P<0.01)。這與Drosinos[27]的結果相同,高濃度食鹽對P.p和L.c的生長代謝有著顯著地抑制性。

表4 不同食鹽濃度下兩種LAB的OD值(660 nm)Table 4 OD value of two kinds of LAB at different salt concentrations(660 nm)

2.1.4 耐亞硝酸鹽性 由表5可看出隨著亞硝酸鹽含量的增加,兩種菌的OD值明顯的減小,當亞硝酸鹽含量為150 mg/kg時,L.c下降了20%,P.p下降了28%,且每個不同濃度梯度的OD值差異性極顯著(P<0.01),說明較高亞硝酸鹽對兩株LAB的生長代謝有顯著抑制作用,但于最大亞硝酸鹽含量下,P.p和L.c的OD值為0.542和0.609,經(jīng)涂布試驗表明還有一部分菌存活。

表5 不同亞硝酸鹽濃度下各菌的OD值(660 nm)Table 5 The optical density of various strains under different nitrite concentrations(660 nm)

2.1.5 相互作用 由表6可知,在不同比例混菌培養(yǎng)的條件下,菌株均可以進行生長、代謝產(chǎn)酸。相比于L.c和P.p的單菌培養(yǎng),混菌培養(yǎng)的pH下降較慢,但在24 h之內也下降到了4.8左右,達到了常規(guī)要求的5.20以下,說明混菌培養(yǎng)可以滿足在肉制品中發(fā)酵的條件。

表6 L.c、P.p以及混合菌種培養(yǎng)的pH變化Table 6 Changes on pH value of P.p,L.c and mixed LAB

注:同行肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05);表7～表11同。

表7 兩種LAB的拮抗反應Table 7 Antagonism between two kinds of LAB

注:此表數(shù)值為菌液濃度的對數(shù)(lg CFU/mL)。

表8 不同配比發(fā)酵劑對發(fā)酵驢肉腸pH和感官品評的影響Table 8 Effect of different proportions of starter on pH value and sensory evaluation of fermented donkey sausage

由表7可知,當P.p和L.c以不同的比例混菌培養(yǎng)與單菌培養(yǎng)來比較,單菌培養(yǎng)的菌落總數(shù)顯著高于混菌培養(yǎng)(P<0.05),此結果說明兩種菌株之間存在拮抗,但不同比例下的混菌均由接種時的1×103CFU/mL增長至1×107CFU/mL以上,混合LAB還是可以進行發(fā)酵產(chǎn)酸。

P.p和L.c之間的拮抗性可能由于菌種在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有抑制對方的作用,導致兩種菌在混合培養(yǎng)時最終pH相較于單菌培養(yǎng)較高,菌落計數(shù)相較于單菌培養(yǎng)相差一個數(shù)量級,王愷[28]研究的三種LAB在發(fā)酵香腸中關于P.p和L.c之間的拮抗關系與本文試驗結果一致。

2.2 發(fā)酵驢肉腸發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗

2.2.1 發(fā)酵劑不同菌種配比對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 由表8可看出,兩組單菌發(fā)酵的香腸在經(jīng)過24 h后pH均顯著(P<0.05)低于混菌發(fā)酵的香腸,說明兩種菌混合培養(yǎng)時由于代謝產(chǎn)物的形成對混菌培養(yǎng)過程中的增殖產(chǎn)酸產(chǎn)生了抑制。

從圖3感官評分結果來看,單菌發(fā)酵的兩組香腸評分極顯著(P<0.01)低于其余五組混菌發(fā)酵,而混菌發(fā)酵的五組之間差異并不顯著。

圖3 不同配比發(fā)酵劑對發(fā)酵驢肉腸感官品評的影響Fig.3 Effects of different ratio starter cultures of the mixed LAB on the sensory evaluation of fermented donkey sausage

經(jīng)過多次重復試驗,混菌發(fā)酵的五組香腸感官評分并無明顯的差異性,卻極顯著(P<0.01)高于兩組單菌發(fā)酵香腸,表明混菌發(fā)酵香腸的風味物質更充沛,感官評分較高。固將發(fā)酵劑配比選為P.p∶L.c=1∶1進行混菌發(fā)酵試驗。

2.2.2 發(fā)酵劑菌液濃度對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 由表9可知,隨著菌液濃度的不斷升高,菌體的產(chǎn)酸能力不斷增強,在菌液濃度為107CFU/mL時,發(fā)酵24 h后香腸的pH下降至4.36,而添加菌液濃度為103CFU/mL的香腸在發(fā)酵24 h后香腸的pH由最初的6.39下降至4.61,遠低于世界衛(wèi)生組織及我國發(fā)酵肉標準中以公布的安全發(fā)酵肉制品的最大pH為5.20,說明兩種LAB可以實現(xiàn)在肉質香腸中快速發(fā)酵產(chǎn)酸,抑制有害微生物的增長,保證發(fā)酵香腸的食用安全性。

表9 不同菌液濃度的添加對pH的影響Table 9 Effects of different concentrations of the mixed LAB on pH

表10 混合LAB不同添加量對pH的影響Table 10 Effect of different additions of mixed LAB on pH

由圖4可以看出當混合LAB的菌液濃度在104、105、106CFU/mL時,感官評分高于其他兩個梯度,在單因素實驗中固定接菌濃度為105CFU/mL,同時選擇104、105、106CFU/mL為正交試驗菌液濃度的三個水平。

圖4 不同菌液濃度添加對感官評定的影響Fig.4 Effect of different concentrations of mixed LAB on sensory evaluation

2.2.3 發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 由表10可以看出,添加量為1%時,pH在發(fā)酵的24 h內由最初的6.53下降至4.58,而當添加量增加至6%時,不僅影響了發(fā)酵開始時肉腸的初始pH,使得初始發(fā)酵時發(fā)酵微生物處于較合適的pH區(qū)間,還加快了發(fā)酵菌株的代謝產(chǎn)酸,經(jīng)24 h發(fā)酵使得發(fā)酵香腸的最終pH為4.19。隨著混合LAB添加量的增加,pH呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖5表示不同添加量下發(fā)酵香腸的感官評分,隨著發(fā)酵最終pH的降低,感官評分呈現(xiàn)逐漸降低的結果?；旌螸AB添加量為1%時感官評分最高,2%添加量的感官評分次之,而添加量為6%時分值最低,可見當最終pH<5.20時,隨著pH的降低,人們的接受度也逐漸降低。結合感官品評與最終pH,1%添加量為當前加工條件下混合LAB于發(fā)酵驢肉腸中較適宜提添加量,選取1%、2%、3%為正交實驗中添加量的三個水平。

表11 不同發(fā)酵溫度對pH的影響Table 11 Effect of different fermentation temperatures on pH

圖5 混合LAB不同添加量對感官品評的影響Fig.5 Effect of different additions of mixed LAB on sensory evaluation

2.2.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 由表11可知,在不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵的香腸,隨著發(fā)酵時間的增加pH降低,但是不同溫度之間的pH變化差異明顯,在20 ℃下發(fā)酵驢肉腸的pH在24 h后降低到了5.73,而在25 ℃下發(fā)酵的香腸在24 h后降低至4.94,與20 ℃處理組的最終pH有顯著性差異(P<0.05),隨著發(fā)酵溫度的增高,pH降低的幅度越大,顯著性越強。

在不同溫度下發(fā)酵,最終pH彼此之間形成顯著差異,原因是在過高或過低溫度下培養(yǎng)會影響發(fā)酵微生物的生長代謝產(chǎn)酸,進而影響發(fā)酵驢肉腸特殊風味的形成降低發(fā)酵過程對驢肉腸感官品質和質構的優(yōu)化。

圖6 發(fā)酵溫度對感官品評的影響Fig.6 Effects of fermentation temperatures on the sensory score

由圖6可以看出,在35 ℃條件下發(fā)酵驢肉腸的感官品評結果最優(yōu),而在40 ℃下品評分數(shù)最低。20、25、30 ℃下品評結果差異不顯著。

在40 ℃下品評結果分數(shù)低可能是由于在高溫下發(fā)酵,發(fā)酵菌生長活力大,代謝產(chǎn)酸快,導致pH的快速下降,發(fā)酵香腸中的風味物質為完全形成而酸味過重,影響發(fā)酵驢肉腸的風味和感官品質;且pH快速的下降,導致內源酶未充分將大分子蛋白分解,蛋白質由于pH快速的改變而發(fā)生變性,導致發(fā)酵驢肉腸組織結構松散肉質不細膩[29]。在20 ℃發(fā)酵條件下,溫度較低,發(fā)酵微生物增長較慢,產(chǎn)酸率較低,pH下降過慢,不能較好地抑制發(fā)酵驢肉腸中的有害微生物的增長[30-31],導致發(fā)酵驢肉腸的食用安全性降低;由于發(fā)酵微生物生長代謝較慢導致發(fā)酵風味不明顯而使發(fā)酵驢肉腸的口感、風味更接近市售加工方便香腸,沒有突出發(fā)酵特色。而在35 ℃下發(fā)酵的驢肉腸,色澤紅潤,酸度適中,香腸細嫩緊致,符合良好發(fā)酵香腸的感官標準,風味獨特,所以35 ℃為當前加工條件下較適發(fā)酵溫度,而選擇25、30、35 ℃為正交試驗溫度的三水平。

2.2.5 發(fā)酵時長對發(fā)酵驢肉腸品質的影響 由圖7可知隨著發(fā)酵時間的不斷增加,發(fā)酵驢肉香腸的pH逐漸降低,在發(fā)酵14 h后,pH達到5.10以下,經(jīng)過發(fā)酵時間的延長,pH緩慢降低,最終到達4.50左右。

圖7 不同發(fā)酵時間對pH的影響Fig.7 Effect of different fermentation time on pH

由圖8可知發(fā)酵時長為16 h時感官評分最高,18、20 h次之,22和24 h的感官評分顯著低于16 h(P<0.05),結合圖2～圖8,可知在22 h后,發(fā)酵驢肉腸的pH已經(jīng)低于4.50,此時感官評分較低說明發(fā)酵時間延長累積產(chǎn)酸增多,人們可接受度降低,故選擇16、18、20 h為正交試驗時長的三水平。

表12 正交試驗表L9(34)Table 12 Orthogonal testTable of L9(34)

表13 正交試驗方差分析Table 13 Orthogonal test analysis of variance

圖8 發(fā)酵時長對感官品評的影響Fig.8 Effect of fermentation time on sensory evaluation

2.2.6 正交試驗 由表12通過對pH直觀分析得出RC>RD>RA>RB,本研究中混合LAB的發(fā)酵溫度對發(fā)酵驢肉腸的pH的影響最大,其次是發(fā)酵時間,菌液濃度對發(fā)酵驢肉腸的pH也有影響,添加量對發(fā)酵驢肉腸pH的影響最小。通過對感官評分結果直觀分析,發(fā)酵時間對感官品評的結果影響最大,其次是發(fā)酵溫度和混合LAB菌液濃度,混合LAB添加量對感官評價影響最小,根據(jù)pH挑選出的較優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A3B3C3D3,由感官品評的結果較優(yōu)發(fā)酵工藝為A3B1C3D3,兩者關于發(fā)酵劑的添加量水平選擇不一致,但是添加量相較于發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對pH的影響較小,所以根據(jù)感官評分的結果,選擇A3B1C3D3為較優(yōu)發(fā)酵條件。

方差分析見表13。

A3B1C3D3不屬于正交試驗9組處理中的一組,所以以相同發(fā)酵處理對其與有最高感官評分的進行驗證試驗,得出表14。

表14 較優(yōu)發(fā)酵條件驗證試驗結論Table 14 Better fermentation conditions test verification results

由表14可知,A3B1C3D3組合pH<5.20,感官評分比A3B1C3D2組評分高,所以選擇A3B1C3D3(發(fā)酵劑的濃度為1×106CFU/mL、添加量為1%、發(fā)酵溫度為35 ℃、發(fā)酵時間為20 h)為較優(yōu)組合。

3 結論

本研究以驢肉為原材料,選用P.p和L.c進行菌種發(fā)酵試驗并對發(fā)酵驢肉腸的發(fā)酵工藝進行研究,通過對兩種發(fā)酵劑的發(fā)酵特性、菌種配比、混合LAB的添加量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素的研究,以及兩種發(fā)酵劑在發(fā)酵產(chǎn)酸過程中對發(fā)酵驢肉腸pH產(chǎn)生的改變,得出:P.p和L.c兩種發(fā)酵菌株均適合應用于發(fā)酵驢肉制品;兩種菌復配培養(yǎng)時有拮抗性,對產(chǎn)酸pH有抑制性,但還可以滿足肉制品快速發(fā)酵的要求,可作為混合發(fā)酵劑,最終復配發(fā)酵劑的配比為P.p∶L.c=1∶1。

通過對混合LAB發(fā)酵劑的發(fā)酵菌種配比、菌液濃度、發(fā)酵劑添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的單因素實驗及適當因子水平的正交結果來看,選取發(fā)酵劑的濃度為1×106CFU/mL、添加量為1%、發(fā)酵溫度為35 ℃、發(fā)酵時間為20 h,在此配比下發(fā)酵的驢肉腸有合格的pH,呈棗紅色,外形飽滿、感官評分優(yōu)。