基于灰色關(guān)聯(lián)分析法評價毛菊苣藥材的質(zhì)量

楊建華， 駱旭東， 臧 薇， 胡君萍

(新疆醫(yī)科大學1第一附屬醫(yī)院藥學部， 烏魯木齊 830054； 2藥學院， 烏魯木齊 830011)

毛菊苣(Cichoriumglandulosum)為菊科菊苣屬毛菊苣植物的干燥地上部分或根[1]，在我國主要生長于新疆南疆地區(qū)。研究表明毛菊苣的主要化學成分為倍半萜、香豆素、黃酮、多糖及微量元素等[2-4]，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫的功效[5-7]，臨床多用于濕熱黃疸，各種肝病的治療[8-9]。本課題組前期采用HPLC法測定毛菊苣根和種子中秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、蘆丁、菊苣酸和槲皮苷等7種化學成分的含量[10]，并對毛菊苣全草和種子不同提取部位對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用進行了研究[11]。中藥藥理活性不僅與藥材中所含化學成分有關(guān)，還與所含微量元素的種類和含量密切相關(guān)，有益的微量元素不僅可以補充人體的缺乏，還能影響人體內(nèi)多種酶的作用而促進藥材的藥理活性，而重金屬元素則會危害人體健康，因此中藥材中相關(guān)無機元素的含量也是評價中藥材質(zhì)量的特征指標[12-13]。裴凌鵬等[14]測定了毛菊苣根中8種微量元素鉀(K)、鎳(Ni)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、錳(Mn)、銅(Cu)和鋅(Zn)的含量，但對毛菊苣種子中微量元素分析，以及與藥材質(zhì)量相關(guān)性的研究未見報道。本研究收集新疆和田地區(qū)不同來源毛菊苣根(10批)和種子(12批)，測定其中10種無機元素、結(jié)合總灰分、酸不溶性灰分、水分、醇溶性浸出物和水溶性浸出物的含量，對各成分的含量進行灰色關(guān)聯(lián)度分析(grey relational analysis，GRA)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器PE900T型火焰石墨爐原子吸收光譜儀(美國Perkin Elmer公司)，AFS9800型原子熒光分光光度計(北京海光儀器有限公司)，BSA224S型電子天平(德國賽多利斯公司)，9FQ-40 型錘片式粉碎機(四川省建安九一錦山機械廠)， KD-S2.4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，DZF-6053型干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，SX2-4-10G型智能箱式高溫爐(蘇州江東精密儀器有限公司)。

1.2 試藥Fe、Ca、Mn、Mg、Se、Cu、Al、Cd、As、Pb標準儲備液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)，硝酸(廣東省精細化學品工程技術(shù)研究研發(fā)中心，批號170909)，氫氧化鉀(天津盛奧化學試劑有限公司，批號20180709)，硼氫化鉀(成都市科龍化工試劑廠，批號2018050301)，高氯酸(天津政成化學制品有限公司，批號20170215)，碘化鉀(天津盛奧化學試劑有限公司，批號20180925)，抗壞血酸(天津市新精細化工開發(fā)中心，批號20180802)，水為純凈。

1.3 藥材2015年10月-2017年12月收集新疆和田地區(qū)不同來源的毛菊苣根10批，毛菊苣種子12批，經(jīng)新疆醫(yī)科大學胡君萍教授鑒定為毛菊苣(Cichoriumglandulosum)的干燥根和種子，見表1。

表1 毛菊苣藥材來源

2 方法

2.1 無機元素含量測定

2.1.1 供試品溶液制備 分別取各批藥材粉碎，過40目篩，稱取藥材粉末1.0 g于燒杯中，加入硝酸-高氯酸(4∶1)消解液10 mL，密封，放置過夜。將消解過夜的樣品置于電熱板上(不超過150℃)，除去硝酸(冒黃煙)，待黃煙散盡，提高溫度至220℃，除去高氯酸(冒白煙)，待樣品白煙散盡取下，放涼，用2%硝酸溶液將樣品轉(zhuǎn)溶至100 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用。同法制備不加藥材的試劑空白溶液。

2.1.2 無機元素測定條件 采用原子吸收石墨爐法測定Cd和Pb的含量，測定條件見表2。采用原子吸收火焰法測定Fe、Ca、Mn、Mg、Cu、Al的含量，測定條件見表3。采用原子熒光法測定Se和As的含量，測定條件見表4。

表2 原子吸收石墨爐法工作條件

表3 原子吸收火焰法工作條件

表4 原子吸收熒光光度計法工作條件

2.1.3 標準曲線的建立 精密吸取標準儲備液配制成系列質(zhì)量濃度的各元素標準溶液，按“2.1.2”項下實驗條件采集各標準溶液測定，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，內(nèi)標校正后的峰強度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，各元素回歸方程見表5。

表5 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分的測定

2.2.1 水溶性浸出物和醇溶性浸出物的測定方法 依據(jù)《中國藥典》(2015版)浸出物測定法分別對毛菊苣根和種子的水溶性浸出物和醇溶性浸出物進行測定。稱取藥材粉末3.0 g，置于250 mL的錐形瓶中，加水100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算供試品中水溶性浸出物的含量。參照水溶性浸出物測定法，以55%乙醇溶液代替水為溶劑，同法測定醇溶性浸出物的含量。

2.2.2 總灰分和酸不溶性灰分的測定方法 依據(jù)《中國藥典》(2015版)灰分測定法對毛菊苣根和種子的總灰分和酸不溶性灰分進行測定。稱取藥材粉末3.0 g置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量，緩緩熾熱至完全炭化時，逐漸升高溫度至600℃，使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中總灰分的含量。在總灰分坩堝中小心加入稀鹽酸10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘渣用水洗于濾紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中酸不溶性灰分的含量。

2.2.3 水分的測定方法 依據(jù)《中國藥典》(2015版)水分測定法(第二法-烘干法)分別對毛菊苣根和種子的水分進行測定。取藥材粉末3 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，稱定，開啟瓶蓋在100～105℃下干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5.0 mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供試品中含水量。

2.3 GRA分析

2.3.1 原始數(shù)據(jù)建立 采用Matlab2018B軟件分析(美國MathWorks公司)，分別以10批根和12批種子中10種微量元素的含量、醇溶性浸出物、水溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分等15個指標測定結(jié)果為數(shù)據(jù)來源構(gòu)成分析單元數(shù)列{Xij}(i=1,2...i, j=1,2,3...15)，其中i為藥材批次，j為質(zhì)量評價指標。

2.3.2 原始數(shù)據(jù)標準化 由于同時存在影響藥材質(zhì)量的正向和負向指標，故對根和種子的原始數(shù)據(jù)進行標準化，即歸一化處理，對7組正向指標Fe、Ca、Mn、Mg、Se 5種微量元素含量、醇溶性浸出物、水溶性浸出物等數(shù)據(jù)處理公式為：Yij=[Xij-min(Xj)]/[max(Xj)-min(Xj)]；對8組負向指標Cu、Al、Cd、As、Pb 5種重金屬元素含量、總灰分、酸不溶性灰分和水分等數(shù)據(jù)處理公式為：Yij=[max(Xj)-Xij]/[max(Xj)- min(Xj)]。

2.3.4 絕對差值計算 根據(jù)各因素無量綱化數(shù)值，進一步求出各批次藥材與各評價指標的絕對差值，即Δoi(k)=|Zij-Zsj|，并分別找出各序列中的最大二級差值Δmax和最小二級差值Δmin。

3 結(jié)果

3.1 不同批來源毛菊苣根和種子中無機元素的含量10批根各批次間10種無機元素含量差異較大，其中含量最高是Ca，其平均含量為7 526.5 mg/kg，含量最低的是Se，其平均含量僅為0.057 6 mg/kg。5種微量元素含量高低依次為：Ca>Mg>Fe>Mn>Se，5種重金屬及有害元素的含量順序為：Al>Cu>Cd>As>Pb。12批種子各批次間10種無機元素含量差異較大，含量最高是Ca，其平均含量為17 030.4 mg/kg，含量最低的是Se，其平均含量為0.039 0 mg/kg，其微量元素和有害元素含量高低順序與根相同。種子中5種微量元素總含量高于根，5種有害元素總含量略低于根，見表6。

表6 毛菊苣藥材無機元素含量(mg/kg， n=3)

3.2 不同來源毛菊苣根和種子中水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分的測定結(jié)果各批次毛菊苣根和種子的水溶性、醇溶性浸出物均不低于10%，種子略高于根；總灰分、酸不溶性灰分和水分均低于10%，種子略低與根，見表7。

3.3 GRA分析結(jié)果10批毛菊苣根灰色關(guān)聯(lián)度Ri范圍為0.654 0～0.757 9，平均值為0.693 8，RSD為4.5%；12批毛菊苣種子灰色關(guān)聯(lián)度Ri范圍為0.661 3～0.731 7，平均值為0.684 7，RSD為3.8%，可見根的質(zhì)量略優(yōu)于種子，但種子質(zhì)量穩(wěn)定性更佳。通過對關(guān)聯(lián)度Ri進行排序，確定根S12質(zhì)量最佳，種子S19質(zhì)量最佳，毛菊苣根和種子關(guān)聯(lián)系數(shù)和灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果分別見表8、9。

表7 毛菊苣藥材水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分(%， n=3)

表8 毛菊苣根各指標的灰色系數(shù)(ξoi)和灰色關(guān)聯(lián)度(Ri)結(jié)果

表9 毛菊苣種子各指標的灰色系數(shù)(ξoi)和灰色關(guān)聯(lián)度(Ri)結(jié)果

4 討論

中藥材的質(zhì)量是藥品安全性和有效性的保障，影響中藥材質(zhì)量的因素很多，如外觀性狀、遺傳基因、化學成分、生物活性等，目前采用多指標結(jié)合數(shù)學分析的方法評價和控制中藥材質(zhì)量[15-17]。GRA的原理在于分析各指標與最優(yōu)指標之間的相關(guān)性和強弱秩序，最終計算出灰色關(guān)聯(lián)度以評價藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，該方法已應(yīng)用于中藥材質(zhì)量評價研究[18-20]。本研究測定了新疆和田地區(qū)毛菊苣種子和根中與藥材質(zhì)量相關(guān)的15個指標，采用GRA分析灰色關(guān)聯(lián)度值，確定新疆和田地區(qū)毛菊苣根的質(zhì)量優(yōu)于種子，種子的穩(wěn)定性優(yōu)于根。研究結(jié)果可為新疆地區(qū)使用毛菊苣根和種子配伍提供依據(jù)。進一步深入研究還需要結(jié)合藥理藥效、化學成分含量及其變化等諸多因素進行綜合評價。