葛根素對人炎性因子腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲促進(jìn)作用的影響及機(jī)制

楊潔 鄭鳳龍 任喜尚

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 450064)

小細(xì)胞肺癌(SCLC)多發(fā)于重度抽煙人群，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈不斷上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類的生命健康〔1〕。臨床多見非NSCLC和小細(xì)胞肺癌這兩種肺癌類型，其中NSCLC約占20%。NSCLC惡性程度高、容易轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差，約2/3患者就診時已進(jìn)入廣泛期〔2,3〕。目前的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療等，但治療效果并不理想。因此，亟待找尋有效的治療方法。腫瘤壞死因子(TNF)-α來源于內(nèi)皮細(xì)胞或活化的巨噬細(xì)胞，是一種具有多種生物學(xué)功能的多肽調(diào)節(jié)因子，在人體免疫過程中發(fā)揮重要作用，但過量的TNF-α則會對人體造成損傷，破壞免疫平衡，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生〔4〕。葛根素(SP)是從傳統(tǒng)中藥葛根根部提取的一種異黃酮-C-葡萄糖苷，藥用價值很大〔5〕。有研究表明SP具有抗癌活性，可降低腫瘤細(xì)胞活力并激活Caspase-3誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡〔6〕。另有研究SP可通過減少Wnt/β-catenin信號通路活化抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡〔7〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9同屬于MMPs家族，均可擾亂腫瘤微環(huán)境平衡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，與腫瘤侵襲密切相關(guān)〔8〕。本研究探究SP對人炎性因子TNF-α誘導(dǎo)的SCLC細(xì)胞遷移和侵襲促進(jìn)作用的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 H446細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，編號為BNCC100065。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清(FBS)和SP單體(美國Gibco-BRL公司，批號分別為SH30809、10099-141和110752-201318)；胰蛋白酶(美國Hyclone公司，批號為J140028)；TNF-α(美國Peprotech公司，批號為300-01A)；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司，批號分別為2500659和354238)；Trizlol reagent(美國Ambion公司，批號為15596026)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(日本Takara公司，批號分別為RR047A和RR02MA)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；全蛋白提取試劑盒，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為BC3711和PC0020)；鼠抗MMP-2，鼠抗MMP-9和鼠抗β-actin(美國Santa Cruz公司，批號分別為sc-13594、sc-21733和sc-58673)；羊抗鼠二抗(普利萊基因技術(shù)公司，批號為C1059)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號為CK04)。

1.1.3主要儀器 MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；Nanodrop2000型超微量分光光度計(美國Thermo公司)；TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；Mx3000P型PCR儀(美國Agilent公司)；Mini-PROTEAN型電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 H446細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10% FBS)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的H446細(xì)胞，接種于含RPMI1640培養(yǎng)液24孔板上(終濃度為5×104個細(xì)胞/ml)，每孔100 μl，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，加入200 μl含不同濃度TNF-α或SP的培養(yǎng)液，使TNF-α終濃度為10 ng/ml(為TNF-α組)，SP終濃度分別為40、80、160、320、640 μg/ml，TNF-α終濃度為10 ng/ml+SP終濃度為320 μg/ml(為TNF-α+SP組)。對照組加入200 μl RPMI1640培養(yǎng)液(為Con組)。

1.3集落形成試驗檢測各組細(xì)胞集落形成能力 用含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液將Con組和TNF-α組H446細(xì)胞制成懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種于內(nèi)含4 ml完全培養(yǎng)液的24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每個處理組細(xì)胞設(shè)置5個平行孔。每孔接入100 μl懸浮液。待培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的集落后，棄培養(yǎng)液；用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入4 ml甲醇在室溫條件下固定15 min；棄甲醇，每孔加入1 ml結(jié)晶紫染液，避光染色15 min；自來水沖洗，晾干后于顯微鏡下計數(shù)。

1.4Transwell實驗檢測H446細(xì)胞遷移、侵襲能力 分別于培養(yǎng)24 h后檢測Con組和TNF-α組細(xì)胞遷移、侵襲水平；72 h后檢測經(jīng)320 μg/ml SP處理細(xì)胞遷移、侵襲水平。

將不同處理組H446細(xì)胞制成懸浮液。在Transwell小室的上室中加入300 μl由RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的細(xì)胞懸浮液(約1×105個細(xì)胞，0.1% FBS)，下室中加入700 μl RPMI1640培養(yǎng)液(含20% FBS)，每個處理組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，用甲醇固定后，0.1%結(jié)晶紫于室溫下染色20 min，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野(200×)對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后取平均值，是為遷移細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)4次。

細(xì)胞侵襲實驗需將40 μl稀釋過的Matrigel基質(zhì)膠(基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液比例為1∶5)加入Transwell小室內(nèi)，37℃孵育2 h。其余步驟與遷移實驗相同。實驗重復(fù)4次。

1.5RT-PCR 用TRIzol reagent提取Con組和TNF-α組(處理24 h)；Con組、TNF-α組和TNF-α+SP組(處理72 h)H446細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA。以此為模板參與PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平。MMP-2的上游引物序列為5′-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3′，下游為5′-CAGCCTAGCCAGTCGGATTTG-3′；MMP-9的上游引物序列為5′-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3′，下游為5′-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游為5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min,共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳后用Bio-Rad凝膠成像儀掃描，Quantity One軟件分析條帶灰度值，計算MMP-2和MMP-9基因的相對表達(dá)量。

1.6Western印跡 提取Con組和TNF-α組(處理24 h)；Con組、TNF-α組和TNF-α+SP組(處理72 h)H446細(xì)胞總蛋白。定量后將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜。取PVDF膜于5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別加入1∶1 000倍稀釋的GAPDH、MMP-2和MMP-9抗體于4℃孵育24 h。洗膜后，加入1∶2 000倍稀釋的二抗于室溫孵育1 h。暗室內(nèi)加入化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯影后，由凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.7CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力 H446細(xì)胞經(jīng)終濃度為40、80、160、320、640 μg/ml的SP處理72 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，再加入100 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測液，37℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處的OD值。細(xì)胞抑制率(%)=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析，LSD-t檢驗，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TNF-α增強(qiáng)SCLC細(xì)胞H446的集落形成能力 如圖1所示，與Con組(克隆形成數(shù)143.39±21.03)相比，TNF-α組H446細(xì)胞集落形成能力明顯升高(克隆形成數(shù)286.94±31.33，P<0.05)。

2.2TNF-α促進(jìn)SCLC細(xì)胞H446的遷移和侵襲 與Con組比，TNF-α組H446細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3TNF-α促進(jìn)SCLC細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá) 與Con組相比，TNF-α作用后，H446細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；Western印跡分析結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，見圖3，表2。

圖1 TNF-α作用后SCLC細(xì)胞H446集落形成情況

組別遷移細(xì)胞侵襲細(xì)胞Con組139±1698±15TNF-α組203±201)189±211)

與Con組比較：1)P<0.05,下表同

圖2 TNF-α作用后SCLC細(xì)胞H446遷移和侵襲情況(×200)

圖3 TNF-α作用后H446細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

2.4SP抑制SCLC細(xì)胞H446的活力 不同濃度(40、80、160、320和640 μg/ml)的SP處理H446細(xì)胞72 h后，對H446細(xì)胞的抑制率分別是(1.23±1.00)%、(2.61±1.30)%、(7.59±1.40)%、(14.43±1.32)%和(22.74±1.31)%。H446細(xì)胞活力均受到抑制，且抑制率隨處理濃度的增大而增大。

為了保證實驗結(jié)果，選取抑制率≥10%的SP濃度(320 μg/ml)作為后續(xù)實驗的處理濃度。

2.5SP抑制TNF-α對H446細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用 與Con組比較，TNF-α組集落形成能力及遷移和侵襲能力均顯著升高(P<0.05)，而TNF-α+SP組無明顯變化。見表3，圖4。

2.6SP抑制TNF-α對SCLC細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)量的促進(jìn)作用 與Con組相比，TNF-α組MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)，而TNF-α+SP組無明顯變化。見表4，圖5。

表2 TNF-α作用后SCLC細(xì)胞H466中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

表3 SP與TNF-α共同作用后SCLC細(xì)胞H466集落形成和遷移侵襲情況個)

圖4 SP與TNF-α共同作用后SCLC細(xì)胞H446集落形成情況

表4 SP與TNF-α共同作用后H466細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

圖5 SP與TNF-α共同作用后H446細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

3 討 論

肺癌是一種重要的致死癌癥，現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共健康負(fù)擔(dān)〔9〕。SCLC是一種惡性程度較高的腫瘤，倍增速度快，極易產(chǎn)生耐藥性。目前，對于復(fù)發(fā)性SCLC暫無有效的治療方法，尋找針對SCLC有效治療靶點是近年來的研究熱點〔10〕。

TNF-α參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)過程，在人類腫瘤中，可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡〔11〕。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過核因子(NF)-κB等信號通路，上調(diào)snail、twist等轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)E-鈣黏蛋白，促進(jìn)乳腺癌、口腔癌的侵襲、轉(zhuǎn)移〔12,13〕。本研究結(jié)果提示TNF-α可促進(jìn)H446細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

SP是一種具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化功能的天然活性物質(zhì)，受到學(xué)者們廣泛關(guān)注〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，SP以濃度依賴的方式抑制人膽管癌QBC939細(xì)胞的生長，其作用機(jī)制與抑制細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C和環(huán)氧合酶(COX)-2表達(dá)水平相關(guān)〔15〕。此外，SP可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1和NF-κB信號通路抑制大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞生長〔16〕。SP對表皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)有特異的抑制活性，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)SP對SCLC細(xì)胞H446的活力有明顯的抑制作用，且這種抑制具有明顯的濃度依賴性，并且抑制細(xì)胞的侵襲與遷移。

MMPs是一類含鋅內(nèi)肽酶的蛋白家族，是機(jī)體維持正常生理發(fā)育和功能必不可少的因子，是腫瘤治療的重要靶點之一。MMPs是以酶原的形式產(chǎn)生，可被其他酶或自由基通過半胱氨酸開關(guān)機(jī)制激活。根據(jù)結(jié)構(gòu)域及序列相似性的不同，MMPs可以分為四大類，其中MMP2和MMP9同屬于明膠酶類，均可降解基底膜的重要的組分Ⅴ型膠原，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用〔18,19〕。其中，MMP9的主要生理功能包括促進(jìn)VEGF的分泌和新血管的生成〔20〕。葉曉星等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒型血管瘤組織中MMP-9的表達(dá)水平明顯高于正常嬰幼兒皮膚組織，推測MMP-9表達(dá)量可作為部分腫瘤的標(biāo)志物。本研究提示SP對TNF-α誘導(dǎo)的SCLC細(xì)胞的抑制作用與MMP-2和MMP-9有關(guān)。