細(xì)胞微絲骨架在NDV誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡中的作用

謝曉娟，金 燕，王 靜，蘭金蘋，武彩霞，劉 宇，劉開揚(yáng)

肺癌是當(dāng)前全球發(fā)病率及死亡率排名前列的惡性腫瘤，對(duì)于肺癌的控制與治療已成為全社會(huì)普遍關(guān)注的問題[1]。溶瘤病毒治療腫瘤以其副作用小、療效顯著被研究者普遍接受[2]。新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)屬于溶瘤病毒的一種[3]，對(duì)人類的正常細(xì)胞無(wú)殺傷作用但對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的殺傷作用[4-5]，課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，NDV HBNU/LSRC/F3株(NDV F3)對(duì)于一些消化道腫瘤細(xì)胞[6-7]有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，而此凋亡過程是否與細(xì)胞關(guān)鍵結(jié)構(gòu)微絲骨架相關(guān)尚未見報(bào)道。鑒于NDV為呼吸道病毒，該研究應(yīng)用NDV F3株感染非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞，以期探究NDV對(duì)NCI-H1299細(xì)胞的影響及其與細(xì)胞微絲骨架的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1299及NDV F3株由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心分子病毒室保存。RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶及細(xì)胞松弛素D(Cytochalasin D)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自上海ExCell Bio公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Annexin V/PI雙染色法凋亡試劑盒及Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗體GAPDH購(gòu)自武漢ABclonal公司；F-actin、RhoA、ROCK2、P-MYPT1及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京博奧森公司；Transwell 3422購(gòu)自美國(guó)康寧公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；掃描電鏡購(gòu)自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) NDV F3原液復(fù)感染指數(shù)(multiplicity of infection， MOI)值為100，將RPMI-1640培養(yǎng)基維持液稀釋的NDV F3，稀釋為不同MOI值(MOI=10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01)；NCI-H1299細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底近80% 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入0.5 ml RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的NDV F3(MOI=1)感染的尿囊液，吸附1 h，加RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.5 ml，使MOI最終為0.1。陰性對(duì)照組加入同樣方式稀釋的正常尿囊液。3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)至12、24、36、48、60 h 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，觀察拍照。

1.2.2掃描電鏡下觀察不同藥物及病毒作用后微絲骨架等超微結(jié)構(gòu)改變 細(xì)胞爬片，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)組加入1 ml NDV F3(終濃度為MOI=0.1)；陰性對(duì)照組加入1 ml正常尿囊液；陽(yáng)性對(duì)照組加入濃度為10 mg/ml的5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 5-FU)；Cytochalasin D組加入濃度為5 μmol/ml Cytochalasin D，培養(yǎng)24 h。設(shè)3個(gè)重復(fù)。24 h后加入戊二醛固定4 h，PBS洗3次，每次10 min。梯度乙醇脫水，叔丁醇置換2次，每次10 min，干燥、噴金后觀察并拍照。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)NDV對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖能力的影響 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化離心計(jì)數(shù)為1×104個(gè)/ml，種入96孔板，每孔200 μl，培養(yǎng)不同時(shí)相點(diǎn)，加入RPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的不同MOI的NDV F3 200 μl(MOI= 1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01)，對(duì)照組加入200 μl同樣稀釋方式的正常尿囊液，設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)至各時(shí)相點(diǎn)后加入20 μl CCK-8試劑，4 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其OD值。

抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)NDV對(duì)NCI-H1299細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H1299細(xì)胞，對(duì)照組為正常細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入NDV F3(終濃度為MOI=0.1)，分別培養(yǎng)12、18、24 h后收集細(xì)胞并離心，冷PBS洗2次，計(jì)數(shù)至1×104個(gè)/ml。按Annexin V/PI雙染色法凋亡試劑盒說明書操作，檢測(cè)凋亡率。

1.2.5Western blot 檢測(cè)NDV對(duì)NCI-H1299細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組加入NDV F3(終濃度MOI=0.1)，培養(yǎng)24 、36、48 h后提取蛋白，對(duì)照組為正常細(xì)胞，根據(jù)蛋白定量結(jié)果加入樣品。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、用5%奶粉封閉1 h、加入一抗4 ℃過夜、洗膜、加入二抗室溫孵育2 h、再洗膜、檢測(cè)拍照。GAPDH為內(nèi)參使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.2.6細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察細(xì)胞感染病毒對(duì)其遷移能力的影響 細(xì)胞消化離心后計(jì)數(shù)至1×104/ml，接種于6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h， 待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗3次，對(duì)照組用10 μl槍頭在孔中心劃一道直線，RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，對(duì)照組加入正常尿囊液；NDV-F3組加入終濃度MOI為0.1的NDV F3；5-FU組加入濃度為10 mg/ml的5-FU，培養(yǎng)48 h。分別在0、48 h拍照，每組設(shè)3個(gè)平行孔，測(cè)量?jī)蓚?cè)細(xì)胞間劃痕距離，比較各組間劃痕愈合的差異。

1.2.7Transwell試驗(yàn)觀察病毒感染細(xì)胞后對(duì)其遷移能力的影響 Matrigel膠融化后用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1 ∶3稀釋。Transwell板提前預(yù)冷，每孔加入50 μl稀釋后的Matrigel膠，37 ℃放置1 h。細(xì)胞接種前用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h去除血清對(duì)其影響，細(xì)胞消化離心計(jì)數(shù)至1×104個(gè)/ml，用MOI為0.1的NDV重懸細(xì)胞，每個(gè)小室中加入200 μl重懸細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，PBS洗2次，多聚甲醛固定15 min，PBS輕洗1次，棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，風(fēng)干后拍照。

2 結(jié)果

2.1 NDV感染人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299后細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及狀態(tài)的改變對(duì)照組正常NCI-H1299細(xì)胞貼壁情況佳，形態(tài)正常，呈典型的上皮細(xì)胞型，鋪石狀，各細(xì)胞間邊界清晰，有折光性；NDV感染12 h后，細(xì)胞折光性變差， 包漿中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞間隙模糊；感染24 h后，細(xì)胞失去正常形態(tài)，細(xì)胞間隙更加模糊，細(xì)胞融合現(xiàn)象明顯，瓶中出現(xiàn)懸浮死細(xì)胞，細(xì)胞失去折光性；感染36 h后，隨感染時(shí)間的增加，胞漿中顆粒性物質(zhì)增多，貼壁細(xì)胞逐漸減少，培養(yǎng)液中可見大量死細(xì)胞及細(xì)胞碎片；感染48 h后，死細(xì)胞進(jìn)一步增多；感染60 h時(shí)，視野下幾乎全為懸浮的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。見圖1。

圖1 普通倒置顯微鏡觀察NDV感染NC1-H1299后細(xì)胞形態(tài) ×100

A：對(duì)照組細(xì)胞；B：NDV F3感染細(xì)胞12 h；C：NDV F3感染細(xì)胞24 h；D：NDV F3感染細(xì)胞36 h；E：NDV F3感染細(xì)胞48 h；F：NDV F3感染細(xì)胞60 h

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果結(jié)果顯示NDV與Cytochalasin D、5-FU都對(duì)細(xì)胞微絲骨架有極大的破壞作用。陰性對(duì)照組正常NCI-H1299細(xì)胞微絨毛纖長(zhǎng)，包覆于整個(gè)細(xì)胞表面，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)正常。NDV F3作用后，相鄰細(xì)胞間的界限模糊甚至消失，細(xì)胞微絨毛變短，部分發(fā)生膨大甚至出現(xiàn)脫落斷裂；微絲解聚陽(yáng)性對(duì)照Cytochalasin D處理組細(xì)胞出現(xiàn)微絨毛的脫落斷裂，細(xì)胞間間隙模糊，并且細(xì)胞表面出現(xiàn)空洞；陽(yáng)性對(duì)照5-FU處理組細(xì)胞表面微絨毛脫落，表面粗糙。見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察細(xì)胞 ×4 000

A：對(duì)照組細(xì)胞；B：NDV F3感染細(xì)胞24 h；C：Cytochalasin D 作用24 h；D：5-FU作用24 h

2.3 CCK-8法結(jié)果NDV F3對(duì)NCI-H1299細(xì)胞有顯著的抑制作用，其作用呈濃度和時(shí)間的依賴性遞增。其中NDV F3(MOI=0.1)抑制作用最佳，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 NDV感染NCI-H1299細(xì)胞后抑制率的影響與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析早期凋亡結(jié)果NDV可誘導(dǎo)NCI-H1299細(xì)胞凋亡，病毒感染12 h，凋亡率為(8.20±2.36)%；感染18 h，凋亡率為(14.27±1.00)%；感染24 h，凋亡率為(18.3±0.56)%。與對(duì)照組(0.21±0.11)%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NDV作用后NCI-H1299細(xì)胞凋亡的影響

A：對(duì)照組；B：NDV F3感染細(xì)胞12 h；C：NDV F3感染細(xì)胞18 h；D：NDV F3感染細(xì)胞24 h；E：凋亡率柱狀圖；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.5 Western blot蛋白表達(dá)結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCI-H1299細(xì)胞隨感染NDV F3(MOI=0.1)時(shí)間的延長(zhǎng)，RhoA、ROCK2、F-actin、P-MYPT1蛋白表達(dá)水平均發(fā)生下調(diào)(P<0.05)，F(xiàn)-actin及RhoA蛋白表達(dá)在24 h時(shí)出現(xiàn)明顯下降，而ROCK2及P-MYPT1蛋白表達(dá)在36 h時(shí)出現(xiàn)明顯下降。見圖5。

2.6 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果NDV F3組細(xì)胞遷移率為(0.091±0.729)%；5-FU組細(xì)胞遷移率為(0.135±0.005)%；與對(duì)照組細(xì)胞遷移率(0.351±0.029)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NCI-H1299感染NDV F3后其劃痕愈合速度與對(duì)照組相比明顯減慢，遷移率與對(duì)照組及5-FU組相比顯著降低，并且NDV F3對(duì)NCI-H1299細(xì)胞遷移作用的影響比抗癌藥物5-FU更顯著。見圖6。

圖5 Western blot分析NCI-H1299細(xì)胞F-actin、P-MYPT1、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)

A：蛋白表達(dá)結(jié)果；B：F-actin；C：P-MYPT1；D：RhoA；E：ROCK2；與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖6 劃痕試驗(yàn)結(jié)果

A：各組細(xì)胞劃痕后間距變化×100；B: 各組細(xì)胞劃痕后遷移率；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.7 Transwell試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照組穿膜細(xì)胞較多，感染NDV F3后穿膜細(xì)胞減少，遷移細(xì)胞數(shù)降低。見圖7。

圖7 Transwell試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)晶紫染色 ×100與對(duì)照組比較：**P<0.01

3 討論

微絲骨架為支撐細(xì)胞形態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂、攝粒和排粒，并且影響軸突的物質(zhì)運(yùn)輸。其結(jié)構(gòu)呈纖維網(wǎng)狀，主要由微管、中等纖維、微絲等結(jié)構(gòu)組成。近年研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，微絲骨架與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，骨架的主要成分微絲、微管出現(xiàn)解聚或聚合異常以及中間絲的結(jié)構(gòu)破壞，都會(huì)導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞骨架內(nèi)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞骨架重組，形成凋亡微管網(wǎng)及凋亡小體，影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。有學(xué)者在研究HL-60細(xì)胞微絲骨架時(shí)發(fā)現(xiàn)，微絲的解聚與細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]。

RhoA/ROCK信號(hào)通路與微絲骨架改變關(guān)系密切，它主要與F-actin結(jié)構(gòu)的形成相關(guān)，主要過程為RhoA與GTP酶結(jié)合后，活化下游的ROCK(ROCK1和ROCK2結(jié)構(gòu)域近90%同源性)，進(jìn)一步磷酸化相同底物：肌球蛋白輕鏈(MLC)和肌球蛋白磷酸酶亞基1(MYPT1)，從而造成一些效應(yīng)分子的改變，形成微絲、偽足等F-actin結(jié)構(gòu)[11]。RhoA/ROCK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的降解、合成、收縮和移動(dòng)方面發(fā)揮著重要的作用，也與細(xì)胞骨架的重建、細(xì)胞極性的改變有著密切的關(guān)系，并影響腫瘤基因的變化[12]。其中RhoA與應(yīng)力纖維及黏著斑的形成有關(guān)并影響微絲骨架的組建。有研究[13]表明，RhoA在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。ROCK是Rho蛋白重要的下游效應(yīng)器，介導(dǎo)下游MLC及MYPT1磷酸化水平，從而影響肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白的交聯(lián)程度以及肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合來(lái)調(diào)控細(xì)胞遷移、形態(tài)改變，微絲骨架重組等多種生物學(xué)行為。有學(xué)者在研究膀胱癌患者中發(fā)現(xiàn)，RhoA與ROCK的表達(dá)與腫瘤的級(jí)別成正相關(guān)[11]，RhoA與ROCK都能夠影響微絲骨架的形成與重組，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并且MYPT1的磷酸化水平與他們活性成正相關(guān)。F-actin為微絲蛋白的多聚體，它的重組影響著細(xì)胞的形態(tài)以及運(yùn)動(dòng)、遷移。F-actin結(jié)構(gòu)破壞，使得細(xì)胞間的連接減少，信號(hào)的傳遞功能減弱；應(yīng)力纖維受損，使得細(xì)胞抵御外界壓力的能力降低，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。該研究表明RhoA、ROCK2、F-actin、P-MYPT1蛋白表達(dá)水平均發(fā)生下調(diào)。這些蛋白表達(dá)的下調(diào)可能因?yàn)殡S著NDV F3作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制RhoA與ROCK2蛋白活性，造成其表達(dá)發(fā)生下調(diào)，從而影響下游的MYPT1的磷酸化，造成其磷酸化水平降低，進(jìn)一步影響應(yīng)力纖維、微絲等F-actin結(jié)構(gòu)的形成，使得F-actin表達(dá)降低。此結(jié)果證實(shí)了NDV F3誘導(dǎo)NCI-H1299細(xì)胞凋亡可能與RhoA/ROCK通路有關(guān)。

F-actin結(jié)構(gòu)的組成與細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移有著密切關(guān)系，通過形態(tài)學(xué)觀察病毒感染后細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)細(xì)胞微絨毛發(fā)生膨大斷裂等現(xiàn)象，這種改變可能由于NDV F3株破壞細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)，造成內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失而形成。使用CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到NDV F3株對(duì)NCI-H1299有抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。F-actin改變不僅與細(xì)胞凋亡相關(guān)，也可影響腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力，其中基質(zhì)金屬蛋白酶類發(fā)揮著重要的作用，它能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)，使得細(xì)胞更容易侵襲和轉(zhuǎn)移，通過在細(xì)胞小室中加入人工細(xì)胞外基質(zhì)，觀察通過小室的細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDV F3具有抑制NCI-H1299細(xì)胞侵襲遷移的作用。