甲狀腺癌的分子診斷現(xiàn)狀研究*

趙慧敏 綜述，王翠峰 審校

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是近30年來全球范圍內(nèi)發(fā)病率增長最快,已翻了3倍的惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌(PTC)和甲狀腺濾泡狀癌(FTC)起源于濾泡細(xì)胞，分別約占甲狀腺惡性腫瘤的80%和15%，而髓樣癌起源于濾泡旁的降鈣素分泌細(xì)胞，僅占不到5%[2]。隨著細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)的廣泛開展和甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)的應(yīng)用，可以通過簡單、安全的操作明確大多數(shù)甲狀腺疾病的診斷，但仍有部分不典型的形態(tài)學(xué)改變難以區(qū)分其性質(zhì)[2]。因此，如何利用各種技術(shù)手段盡早識別甲狀腺結(jié)節(jié)的性質(zhì)，使惡性腫瘤或者臨界患者能夠得到早期診斷并及時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療，是臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查應(yīng)用于術(shù)前評估甲狀腺腫瘤，使診斷意義不明確的細(xì)胞非典型性病變、可疑濾泡性腫瘤、可疑惡性腫瘤病例分別有5%～10%、15%～30%和50%～75%的患者確診為惡性病變。對甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行分子標(biāo)記物，如鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1(BRAF)基因、轉(zhuǎn)染中重排(RET)基因/PTC基因、大鼠肉瘤病毒(RAS)基因等分析，可以輔助細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，明顯提高術(shù)前診斷的準(zhǔn)確性，并且提供疾病轉(zhuǎn)移、預(yù)后等信息[3-4]。

1 BRAF基因突變

已發(fā)現(xiàn)的BRAF基因突變多達(dá)數(shù)十種，BRAF V600E點(diǎn)突變是PTC中最常見的基因改變，在接近半數(shù)的經(jīng)典型PTC病例中可以檢測到，而且在分化良好的濾泡狀癌中較少見[5-6]。BRAF是一種參與細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的絲氨酸/色氨酸激酶，其編碼基因位于染色體7q24，當(dāng)BRAF基因的1799位的堿基由T變成A致使本來編碼的谷氨酸被纈氨酸所取代時(shí)，將持續(xù)性引起B(yǎng)RAF激酶的激活和MAPK通路的活化，使甲狀腺細(xì)胞不斷增殖而產(chǎn)生腫瘤[5-7]。BRAF V600E點(diǎn)突變可見于60%的典型PTC、80%的高細(xì)胞變異型及10%的濾泡變異型PTC中，但在分化比較差的甲狀腺癌(尤其是含有部分分化較好的乳頭狀癌組織的腫瘤)中也可以出現(xiàn)，且在分化程度不同的組織中均可檢測出，提示該突變在腫瘤發(fā)生的早期即可出現(xiàn)[7]。因此，BRAF基因突變可作為PTC及其相關(guān)型腫瘤的特異性較高的分子標(biāo)志物。BRAF V600E點(diǎn)突變還與腫瘤的分期、周圍組織浸潤、頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等侵襲性有關(guān)，可以作為PTC預(yù)后評估的分子標(biāo)志物[8-9]。此外，在預(yù)測治療效果較差和腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤相關(guān)死亡等不良事件方面，BRAF V600E點(diǎn)突變也有重要意義[9]。BRAF V600E點(diǎn)突變陽性腫瘤的強(qiáng)侵襲性可能與其所致的去分化傾向，以及突變引起的鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體和其他碘代謝相關(guān)基因功能改變有關(guān)，繼而導(dǎo)致腫瘤對放射性碘的吸收能力下降、治療無效。對于術(shù)前細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查到該突變?yōu)殛栃哉?，通過術(shù)中預(yù)防性清掃頸部淋巴結(jié)、術(shù)后增加放射性碘治療劑量、降低促甲狀腺激素抑制劑和增加隨訪頻率等手段，或?qū)⑻岣咂湓\療效果[10]。

2 RET基因

RET基因是定位于10q11.2的編碼酪氨酸激酶膜受體的原癌基因，其激活可導(dǎo)致MAPK等幾個(gè)促使細(xì)胞增殖、分化的信號通路激活。通常RET蛋白在甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)和交感神經(jīng)節(jié)等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在甲狀腺濾泡細(xì)胞中不表達(dá)，因此，RET基因突變攜帶患者可發(fā)生多個(gè)系統(tǒng)的疾病。起源于濾泡旁C細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌(MTC)大多數(shù)為散發(fā)型，占15%～30%的遺傳性MTC以常染色體顯性方式遺傳。在高達(dá)98%的遺傳性MTC中存在RET基因的胚系突變，在30%～70%的散發(fā)型MTC中檢測到RET基因的體細(xì)胞突變[11]。遺傳性MTC主要有以下3種：合并有嗜鉻細(xì)胞瘤及原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)的多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤(MEN)2A型，伴有嗜鉻細(xì)胞瘤、多發(fā)黏膜神經(jīng)瘤、腸道多發(fā)神經(jīng)節(jié)瘤和馬凡體型等骨骼肌發(fā)育異常的MEN 2B型，以及無其他腺體受累的單純家族性MTC。其中MEN 2A型中約有80%的RET基因突變發(fā)生在第10、11外顯子的突變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外半胱氨酸殘基改變、結(jié)構(gòu)性二聚體形成，引起細(xì)胞內(nèi)激酶被激活[12]；而在MEN 2B型和散發(fā)型MTC中最常見的是M918T突變，僅影響細(xì)胞內(nèi)部分酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)的改變。由于這些突變的外顯率近100%，針對攜帶RET基因突變的患者常規(guī)行預(yù)防性甲狀腺切除術(shù)，手術(shù)時(shí)機(jī)則依據(jù)個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)評估選擇，而用于檢出家族性MTC患者和易感者的手段，也逐漸由全基因組測序或其他以RET突變?yōu)榘邢虻姆椒ㄌ娲藗鹘y(tǒng)的降鈣素監(jiān)測[13]。在散發(fā)型MTC中，M918T RET突變與疾病較差的預(yù)后相關(guān)，與家族性MTC比較，患者雖發(fā)病年齡較晚，但更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期縮短[14]。

3 RET/PTC重排

點(diǎn)突變并非是RET基因參與甲狀腺癌發(fā)生的唯一分子學(xué)改變方式，該基因還可以通過染色體重排方式產(chǎn)生與其他多種基因重組的融合基因，導(dǎo)致編碼酪氨酸激酶的RET基因3′端與多種不相關(guān)基因的5′端融合，異常激活甲狀腺細(xì)胞膜上非受體依賴性MAPK通路。目前已發(fā)現(xiàn)多種RET/PTC重組類型出現(xiàn)在10%～20%的PTC患者中，但其中最常見的為10號染色體長臂臂內(nèi)倒位形成的RET/PTC1和RET/PTC3重組，分別約占RET/PTC重組改變的2/3和1/3。RET/PTC1是因?yàn)榘l(fā)生inv(10)(q11.2;q21.2)導(dǎo)致RET基因與含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)6基因融合，多見于典型PTC[15]；RET/PTC3則是由于inv(10)(q11.2;q11)致RET基因與核共激活蛋白4基因融合，以細(xì)胞遺傳學(xué)分析難以檢出該倒位，可見于約79%的實(shí)性亞型PTC患者，且該重排在有放射暴露史及散發(fā)性兒童甲狀腺癌患者中頻發(fā)[16-17]。盡管RET/PTC重排可作為乳頭狀癌細(xì)胞克隆增生的標(biāo)志，但是在甲狀腺腺瘤、甲狀腺結(jié)節(jié)、橋本氏甲狀腺炎等疾病中也有出現(xiàn)，且該重排與術(shù)后高促甲狀腺激素水平也相關(guān)[18]。

4 RAS基因

RAS基因家族由分別定位于12、11和1號染色體上的K-RAS、H-RAS和N-RAS 3種成員組成，它們編碼位于細(xì)胞膜內(nèi)表面的G蛋白，參與始于細(xì)胞膜表面受體酪氨酸激酶和G蛋白耦聯(lián)受體的MAPK和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)2個(gè)通路的信號傳導(dǎo)。RAS基因突變會導(dǎo)致G蛋白對鳥苷三磷酸的親和力異常增強(qiáng)，持續(xù)活化并激活其下游信號通路，引起腫瘤細(xì)胞無限增殖。RAS基因突變在起源于濾泡細(xì)胞的多種不同類型的病變中出現(xiàn)概率不盡相同，可見于10%～20%的乳頭狀癌，且絕大多數(shù)的組織學(xué)分類為濾泡變異型PTC，在40%～50%的濾泡癌和20%～40%的濾泡性腺瘤中可以檢測到該突變，但惡性甲狀腺腫瘤較良性者突變率更高[19]。與人類其他惡性腫瘤中常見的RAS基因第12、13位密碼子突變不同，甲狀腺惡性腫瘤最常出現(xiàn)的是H-RAS和N-RAS基因的第61位密碼子突變[20]。RAS突變陽性、超聲檢查缺乏惡性特征、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查為意義不明改變的甲狀腺結(jié)節(jié)，通常提示低危的濾泡狀癌，其淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移少見但多有雙側(cè)累及[21]。RAS突變陽性對于細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查難以診斷的濾泡變異型PTC有重要診斷價(jià)值，其陽性預(yù)測值可達(dá)74%～88%；部分被診斷為良性結(jié)節(jié)的具有RAS突變的病例，可能是假陽性結(jié)果，但也很可能為濾泡變異型PTC或?yàn)V泡癌的前期病變[22]。

5 配對核基因(PAX8)/過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)基因

PAX8對甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白及促甲狀腺素受體基因啟動子的表達(dá)起調(diào)控作用,可促使甲狀腺細(xì)胞分化；而PPARγ基因不僅可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化,還參與細(xì)胞凋亡、腫瘤形成等。PAX8/PPARγ融合基因是由2號和3號染色體易位t(2;3)(q13;p25)形成并導(dǎo)致PPARγ過度表達(dá)，是FTC中僅次于RAS突變的第2位常見的基因改變，在30%～40%的FTC患者中可檢出該融合基因。PAX8/PPARγ融合基因陽性的患者往往發(fā)病年齡更小、腫瘤體積較小，更易發(fā)生被膜和血管浸潤轉(zhuǎn)移[23]。大約有5%的PTC患者也可出現(xiàn)PAX8/PPARγ融合基因，且其中大多數(shù)為濾泡變異型PTC，但在2%～13%的濾泡型腺瘤中也檢測到該基因[24]。盡管PAX8/PPARγ基因的致癌機(jī)制未闡明，其陽性并不能作為診斷FTC的充分證據(jù)，但可以提示病理醫(yī)生更加仔細(xì)地徹底檢查整個(gè)腫瘤，以免漏檢血管侵犯。

6 其他基因改變

編碼酪氨酸激酶受體的神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(NTRK1)基因定位于1號染色體長臂q21-q22，當(dāng)它與1q22-1q23的原肌球蛋白3基因、1q25的易位啟動子區(qū)基因或3q11的轉(zhuǎn)羥乙醛酶融合基因發(fā)生易位時(shí)，融合基因?qū)е峦ǔＴ诩谞钕贋V泡細(xì)胞不表達(dá)的NTRK1基因持續(xù)被激活，以RET/PTC類似的機(jī)制激活MAPK通路而引起腫瘤細(xì)胞增殖。以上基因重排可見于5%～10%的PTC患者中，與組織學(xué)亞型無特異關(guān)聯(lián)，且在不同地域和人群中的發(fā)生概率差異較大[25]。

部分家族遺傳性PTC患者也發(fā)現(xiàn)了呈常染色體顯性遺傳的基因突變，例如表現(xiàn)為家族性多發(fā)性腺瘤病的腺瘤性結(jié)腸息肉病基因突變攜帶者患者，PTC尤其是篩狀乳頭狀癌的易感性明顯增高[26]；以多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤、皮膚色素沉著、內(nèi)分泌功能亢進(jìn)為特點(diǎn)的Carney綜合征是由蛋白激酶依賴型1型調(diào)節(jié)亞單位α基因突變所致，該基因位于17q22-24，編碼蛋白激酶A的調(diào)節(jié)亞基，在環(huán)磷酸腺苷信號傳導(dǎo)通路中起重要作用，也被證實(shí)與遺傳性PTC有關(guān)。此外，定位于1q21、2q21、8p23、1-p22、14q31和19p13.2的多個(gè)基因位點(diǎn)也表現(xiàn)出與家族性PTC相關(guān)[27]。

PIK3CA基因?qū)儆赑I3K家族，是PI3K/張力蛋白同源的第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)/AKT通路的重要組成部分，其突變主要發(fā)生在第9和第20外顯子上。PIK3CA基因突變可見于6%～13%的FTC病例和5%～25%的未分化癌，而PTC中罕見[28]。定位于10q23的PTEN基因胚系突變也通過PTEN/AKT通路導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。6%～12%的FTC和5%～20%的未分化癌是由于PTEN突變、功能喪失導(dǎo)致AKT等下游信號激活而發(fā)生的。常染色體顯性遺傳的Cowden綜合征患者有10%～20%發(fā)生甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，通常為FTC，且良性腺瘤等甲狀腺損傷的患病率也比較高，也與PTEN基因突變有關(guān)[29]。PIK3CA和PTEN基因突變很少同時(shí)出現(xiàn)于分化較好的甲狀腺癌中，但二者常伴隨BRAF或RAS基因突變存在，提示這兩種突變是腫瘤進(jìn)展到較晚期時(shí)才發(fā)生的分子學(xué)事件。AKT也稱為蛋白激酶B,也是PI3K/PTEN/AKT通路的關(guān)鍵組分，AKT基因突變可使其持續(xù)激活，導(dǎo)致對放射性碘治療不敏感的高度惡性甲狀腺癌發(fā)生，并且與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[30]。

腫瘤蛋白P53基因定位于17號染色體短臂，有高達(dá)50%的人類惡性腫瘤與此基因突變相關(guān)，也與甲狀腺癌的去分化及進(jìn)展有關(guān)，常提示預(yù)后不良。約1/3的甲狀腺低分化癌和50%～80%的未分化癌中有TP53突變[31]，通常檢測的是第5和第8外顯子，以免疫組織化學(xué)染色可檢測到40%～50%的此類腫瘤所表達(dá)的P53蛋白。

7 小 結(jié)

在甲狀腺結(jié)節(jié)病變出現(xiàn)PTC和FTC常見基因改變時(shí)，可以提高惡性病例的檢出率，通過應(yīng)用不斷被發(fā)現(xiàn)的多種分子標(biāo)志物，明顯提高甲狀腺癌診斷的準(zhǔn)確性。在美國甲狀腺學(xué)會最新修訂的指南中也建議對術(shù)前細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查意義不明確的病變進(jìn)行基因標(biāo)志物檢測，如RET/PTC、BRAF、PAX8/PPARγ、RAS等突變檢測。對于FNA已確診為癌變的結(jié)節(jié)，分子標(biāo)志物檢測的診斷價(jià)值雖難以體現(xiàn)，但是有助于理解疾病發(fā)生的機(jī)制，選擇合適的靶向治療藥物，可輔助評估預(yù)后。以有效的檢測方法檢出BRAF基因突變的非典型病變對PTC診斷有較高的特異度，且提示腫瘤侵襲性較強(qiáng)，RET/PTC克隆性重排也為PTC診斷提供了有力的證據(jù)。目前已出現(xiàn)BRAF V600E基因的抑制劑，可有效治療PTC和未分化癌。某些突變陽性對甲狀腺癌的診斷意義尚存爭議，但是仍有利于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)誤診為良性的疾病或癌前病變，并及時(shí)手術(shù)切除結(jié)節(jié)預(yù)防惡變。基因診斷彌補(bǔ)了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)技術(shù)的不足，但是其靈敏度和特異度尚存在局限性；聯(lián)合檢測多種基因改變雖可改善甲狀腺疾病的診斷，避免不必要的診斷性手術(shù)，但其費(fèi)用高昂、對檢測技術(shù)的要求較高，故廣泛應(yīng)用于臨床仍存在較多問題。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將不斷發(fā)現(xiàn)有利于甲狀腺癌診斷的分子標(biāo)志物，完善各類檢測技術(shù)手段，提高診斷的準(zhǔn)確性和患者的預(yù)后。