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      節(jié)律基因clif單核苷酸多態(tài)性與老年急性心肌梗死患者的相關(guān)性研究

      2020-02-11 02:58:12呂煒俊王云鄉(xiāng)應(yīng)婕
      關(guān)鍵詞:節(jié)律空白對照多態(tài)性

      呂煒俊,王云鄉(xiāng),應(yīng)婕

      (永康市第一人民醫(yī)院 心內(nèi)科,浙江 永康 321300)

      急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死,多表現(xiàn)為胸骨后疼痛,可并發(fā)心律失常、休克等,常危及生命[1]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指單個核苷酸變異所導(dǎo)致DNA序列多態(tài)性,有研究表明AMI 與易感基因SNP 密切相關(guān)[2-3]。許多心血管疾病的發(fā)作一般都會發(fā)生在某一特定時間段,比如AMI 多半在早晨突發(fā),呈現(xiàn)較明顯的生物節(jié)律性。節(jié)律基因包括clock、period 和clif等,相關(guān)研究表明心血管疾病發(fā)生可能與節(jié)律基因突變或表達異常存在關(guān)聯(lián)[4]。絕大多數(shù)AMI 發(fā)生是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或內(nèi)皮損傷,凝血系統(tǒng)被激活,促使血栓形成,血管內(nèi)皮損傷在AMI 發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin, TM)是一種具有清除凝血酶、活化抗凝因子的糖蛋白,可在抗凝因子蛋白C 協(xié)同作用下減少血栓的形成,是血管內(nèi)皮細胞活化標志物,是反映血管內(nèi)皮損傷的較敏感指標之一[5]。纖溶酶原激活抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是一種與血漿波基結(jié)合素結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物發(fā)揮活性的單鏈糖蛋白,可降低凝血及血栓形成[6]。為進一步明確節(jié)律基因在AMI 中發(fā)揮的作用及機制,本研究以老年AMI 患者為研究對象,以探討節(jié)律基因clif 單核苷酸多態(tài)性與該病的相關(guān)性,clif 與PAI-1、TM等鐘控基因的關(guān)系,為臨床防治AMI 及尋找新的早期預(yù)警指標提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 研究對象

      選取2016年7月—2018年3月永康市第一人民醫(yī)院收治的、符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]、《2016年中國成人血脂異常防治指南》等[8]標準的126 例老年AMI 患者作為病例組。納入標準:意識清晰,無精神病史;無嚴重瓣膜病或心房顫動等;無嚴重凝血功能障礙或肝腎疾??;無腦梗死或惡性腫瘤者;依從性良好者等。排除標準:惡性腫瘤者;腦梗死者;心房顫動者;嚴重肝腎疾病者;周圍動脈栓塞者;依從性差者等。同期選取132 例健康體檢者作為對照組。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。所有研究對象均知情同意,并簽署知情同意書。

      1.2 動物及試劑

      C57BL/6J 小鼠(由南京大學(xué)模式動物研究所提供),clif 基因慢病毒干擾試劑盒(中國上海吉瑪公司),Trizol 試劑盒(美國Invitrogen 公司),SNaP shot 試劑盒(美國ABI 公司),血漿PAI-1 和TM 酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(美國Sigma 公司),DNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)試劑盒(日本TaKaRa 公司),PCR 擴增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計、合成],熒光定量PCR 儀(美國羅氏公司)、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司),Nano Drop 2000c 紫外分光光度計(美國Thermo Scientific 公司)。

      1.3 實驗方法

      所有研究對象空腹采外周血5 ml,利用酚-氯仿有機油提法提取外周血細胞DNA,根據(jù)NCBI PubMed等篩選節(jié)律基因clif 位點,選擇標準為人群(漢族)具有較高頻率(MAF ≥0.05)、各位點間連鎖平衡r2≥0.8,再結(jié)合文獻,最終挑選rs2583913 和rs1071592 2 個位點。采用單堿基引物延伸法(SNaP shot 法)檢測多態(tài)性位點rs2583913 和rs1071592 在病例組和對照組中的SNP 基因型和等位基因頻率分布。

      C57BL/6J 小鼠慢病毒轉(zhuǎn)染制備過程大致如下:構(gòu)建clif 基因慢病毒干擾質(zhì)粒,慢病毒組轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞后,輸注到C57BL/6J 小鼠體內(nèi),作為慢病毒轉(zhuǎn)染組。慢病毒對照組的制備方法同慢病毒轉(zhuǎn)染組,輸注空白質(zhì)粒??瞻讓φ战M輸注生理鹽水。每組15 只C57BL/6J 小 鼠 采 用qRT-PCR 檢 測 其PAI-1 及TM mRNA 的表達水平;運用ELISA 檢測干擾前后小鼠血漿中PAI-1、TM 及clif 表達量的變化?;蛞镄蛄幸姳?。

      1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

      數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較采用t檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較采用χ2檢驗;采用Hardy-Weinberg 平衡檢驗計算基因頻率分布差異程度;采用基因計數(shù)法分析基因頻率及基因型分布頻率。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      表1 基因引物序列

      2 結(jié)果

      2.1 兩組研究對象的基線資料比較

      兩組研究對象的性別、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、年齡、收縮壓、血小板、甘油三酯、高密度脂蛋白及總膽固醇比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);兩組舒張壓、心率、白細胞計數(shù)、低密度脂蛋白、空腹血糖及肌鈣蛋白比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),病例組高于對照組。見表2。

      2.2 兩組clif 基因多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率分布情況

      經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗,發(fā)現(xiàn)各基因型分布頻率達到遺傳平衡(P>0.05);兩組rs2583913 基因型及等位基因頻率分布情況比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);兩組rs1071592 基因型及等位基因頻率分布情況比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

      2.3 慢病毒干擾沉默clif 后,小鼠血漿clif、PAI-1和TM mRNA 表達情況

      慢病毒轉(zhuǎn)染組均轉(zhuǎn)染成功。以空白對照組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 表達量為1.0 作為參照,慢病毒對照組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相對表達量分別為(0.9±0.1)、(0.9±0.1)及(0.9±0.1),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);慢病毒轉(zhuǎn)染組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相對表達量分別為(0.2±0.1)、(0.4±0.2)及(0.6±0.1),均低于空白對照組及慢病毒對照組(P<0.05)。見圖1。

      表2 兩組患者的基線資料比較

      表3 兩組clif 基因各位點基因型及等位基因頻率分布情況 例(%)

      2.4 慢病毒干擾沉默clif 后,小鼠血漿中TM 和PAI-1 蛋白水平表達

      各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);慢病毒對照組和空白對照組血漿中TM 和PAI-1 蛋白表達量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);慢病毒轉(zhuǎn)染組血漿TM、PAI-1 蛋白表達量均低于空白對照組及慢病毒對照組(P<0.05)。見表4。

      表4 各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較(n =15,±s)

      表4 各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較(n =15,±s)

      注:?與空白對照組或慢病毒對照組比較,P <0.05。

      組別 TM PAI-1空白對照組 49.2±12.3 22.6±5.1慢病毒對照組 47.6±11.5 21.8±4.8慢病毒轉(zhuǎn)染組 39.2±7.4? 17.6±3.3?F 值 3.838 5.415 P 值 0.029 0.008

      3 討論

      AMI 是由于冠狀動脈內(nèi)血栓形成而引起,導(dǎo)致凝血及纖溶系統(tǒng)功能紊亂,及時抗凝治療可以有效減少心肌壞死面積,改善預(yù)后[9]。時間生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),AMI大部分發(fā)生于早晨,中樞生物節(jié)律以及外周生物鐘紊亂,會增加心血管疾病的發(fā)生,節(jié)律基因與AMI 發(fā)病密切相關(guān)[10-11]。在大多數(shù)心血管疾病的病理過程中,存在有生物節(jié)律基因和相應(yīng)的鐘控基因的異常表達,而該基因在疾病的病理過程中發(fā)揮各自的作用[12-14]。一般情況下,近日節(jié)律基因變化情況可以反映心血管系統(tǒng)是否正常。

      本研究發(fā)現(xiàn),病例組與對照組clif rs1071592 位點基因型及等位基因頻率分布情況均有差異,rs2583913位點基因型及等位基因頻率分布情況均無差異。表明clif 基因多態(tài)性位點rs1071592 與AMI 存在一定相關(guān)性。TM 與PAI-1 在機體凝血及血栓形成中扮演重要角色,當TM與PAI-1基因表達異常時,機體血凝及抗血栓功能均將失調(diào)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TM及PAI-1基因表達下調(diào),機體血凝及抗血栓功能減弱,易導(dǎo)致血管中形成血栓[15]。PAI-1作為鐘控基因產(chǎn)物之一,正常情況下表現(xiàn)出近日節(jié)律。相關(guān)研究表明,clock突變小鼠的纖溶活性較低,且PAI-1無近日節(jié)律[16]。表明,clock基因通過調(diào)控PAI-1來影響機體纖溶系統(tǒng),進而對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生影響。為此,本研究基于上述結(jié)論,推測clif 對PAI-1可能存在類似的調(diào)控機制。為進一步驗證這一推測,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢病毒轉(zhuǎn)染組clif、PAI-1 及TM mRNA 表達水平均低于空白對照組及慢病毒對照組。另外,慢病毒轉(zhuǎn)染組血漿TM、PAI-1 蛋白表達水平均低于空白對照組及慢病毒對照組。表明clif 基因變異可導(dǎo)致TM、PAI-1等鐘控基因的節(jié)律消失,易導(dǎo)致血管中血栓的形成。

      綜上所述,節(jié)律基因clif 單核苷酸多態(tài)性位點rs1071592 與老年AMI 患者存在相關(guān)性。節(jié)律基因clif 表達可降低慢病毒干擾小鼠的PAI-1 及TM 表達水平,增加血栓形成風險。本研究為節(jié)律基因在AMI中的作用及機制提供重要實驗依據(jù)。

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