恩替卡韋分散片微生物限度檢查方法適用性研究*

吳偉平，陳宇，黃麗華，梁蔚陽(yáng)

（廣東省藥品檢驗(yàn)所生物制品室·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局血液制品質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·廣東省藥品監(jiān)督管理局血液制品質(zhì)量控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663）

1 試藥、菌種與儀器

樣品：恩替卡韋分散片，樣品1（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為170101，規(guī)格為每片0．5 mg）；樣品2（蘇州東瑞制藥有限公司，批號(hào)為160517105，規(guī)格為每片0．5 mg）；樣品3（安徽貝克生物制藥有限公司，批號(hào)為167070058，規(guī)格為每片0．5 mg）；樣品4（海南中和藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20170101，規(guī)格為每片0．5 mg）；樣品5（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)為170209101，規(guī)格為每片0．5 mg）；樣品6（江西青峰藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20170111，規(guī)格為每片0．5 mg）。

菌種：大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，金黃色葡萄球 菌［CMCC（B）26003］，銅 綠 假 單 胞 菌［CMCC（B）10104］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）26003］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，均為第3代。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，按使用說(shuō)明書(shū)配制，培養(yǎng)基適用性符合規(guī)定。

儀器：CL-40M型高壓滅菌器（日本ALP株式會(huì)社）；GRX-12A型干熱消毒箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；MIR-254-PC型恒溫培養(yǎng)箱（松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社）；BS323S型電子天平（賽多利斯公司，萬(wàn)分之一）。

2 方法與結(jié)果

2．1 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2．1．1 菌液制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB中，經(jīng)32℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)物用無(wú)菌0．9%氯化鈉溶液10倍稀釋至每1 mL含菌數(shù)為不大于1×104cfu的菌懸液，備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至SDB中，經(jīng)23℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)物用無(wú)菌0．9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為不大于1×104cfu的菌懸液，備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)23℃培養(yǎng)7 d后，加入5 mL含0．05%聚山梨酯80的無(wú)菌0．9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液置無(wú)菌試管內(nèi)，用含0．05%聚山梨酯80的無(wú)菌0．9%氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)不大于1×104cfu的孢子懸液。備用。

2．1．2 供試液制備

負(fù)向遷移即母語(yǔ)干擾,主要是由于母語(yǔ)和目的語(yǔ)的某些形式和規(guī)則系統(tǒng)不同而被(學(xué)習(xí)者)誤以為相同所致，從而對(duì)學(xué)習(xí)產(chǎn)生不利影響。有學(xué)者對(duì)母語(yǔ)在二語(yǔ)習(xí)得中的負(fù)遷移影響進(jìn)行了詳細(xì)地概括。

稱(chēng)取樣品10 g，加pH 7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試液。取上述供試液50 mL，加pH 7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，作為1∶20的供試液。

2．1．3 回收比值測(cè)定

采用平皿法（傾注法）測(cè)定。

試驗(yàn)組：取含菌量不大于1×104cfu／mL的菌懸液0．1 mL分別加至10．0 mL（1∶10，1∶20）供試液中，混勻。取上述供試液1．0 mL，置直徑為90 mm的平皿中，注入20 mL溫度不超過(guò)45℃熔化的培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌組傾注TSA，白色念珠菌、黑曲霉組傾注TSA和SDA 2種培養(yǎng)基），每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基分別平行制備2組平皿，混勻，凝固。TSA倒置于32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，SDA倒置于23℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察培養(yǎng)結(jié)果，并計(jì)數(shù)。

供試品對(duì)照組：取供試液，以pH7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗(yàn)組方法操作。

菌液對(duì)照組：取pH 7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組方法操作加入試驗(yàn)菌液，并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

計(jì)算方法：回收比值＝（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）／菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)。

2．1．4 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

6個(gè)樣品的平皿法（1∶10供試液，1∶20供試液）微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有微弱的抑制作用，回收比值范圍為0．5～2．0；對(duì)黑曲霉未表現(xiàn)出抑菌作用，回收比值均大于0．86。隨著供試品濃度的稀釋?zhuān)┰嚻穼?duì)5種代表菌株的抑制作用均有不同程度的減弱，回收比值增大，數(shù)值穩(wěn)定。根據(jù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果，確定恩替卡韋分散片微生物限度檢查法為需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均采用1∶20的供試品進(jìn)行平皿法（傾注法）檢查。

2．2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2．2．1 檢測(cè)依據(jù)

恩替卡韋分散片為口服給藥制劑，按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》微生物限度要求，應(yīng)對(duì)大腸埃希菌作控制菌檢查。

2．2．2 溶液制備

稱(chēng)取樣品10 g，加pH 7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，混勻，作為1∶20的供試液。接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB中，經(jīng)32℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)物用無(wú)菌0．9%氯化鈉溶液10倍稀釋至每1 mL含菌數(shù)不大于1×102cfu的菌懸液，備用。

表1 恩替卡韋分散片微生物檢查回收比值（1∶10供試液／1∶20供試液）

2．2．3 方法適用性試驗(yàn)與結(jié)果

試驗(yàn)組：取上述1∶20供試液20 mL及含菌量為不大于1×102cfu／mL大腸埃希菌的菌懸液1 mL加至200 mL TSB中，32℃培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，43℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于MAC平板上，32℃培養(yǎng)72 h。

供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，以pH＝7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗(yàn)組方法操作。

菌液對(duì)照組：取pH 7．0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，同試驗(yàn)組方法操作。

結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，6個(gè)樣品控制菌試驗(yàn)組與菌液對(duì)照組結(jié)果均為陽(yáng)性（＋），檢出大腸埃希菌，供試品對(duì)照組均未檢出，表明恩替卡韋分散片可按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》控制菌（大腸埃希菌）檢查法行大腸埃希菌檢查，經(jīng)方法適用性試驗(yàn)成立。

表2 恩替卡韋分散片控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)與控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)是確認(rèn)供試品在所采用檢查方法和檢驗(yàn)條件下，藥物抑菌作用盡可能被降低甚至達(dá)到無(wú)抑菌作用，以保證供試品中被污染的微生物能被檢出。具有抑菌成分的藥物進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，要求供試品本身在試驗(yàn)條件下有效排除其抑菌作用，使其不干擾染菌的限度檢驗(yàn)，結(jié)果方屬有效［9］。當(dāng)有幾種計(jì)數(shù)方法回收比值同時(shí)達(dá)到0．5～2．0時(shí)，應(yīng)綜合考察結(jié)果的穩(wěn)定性，操作的易行性及觀察的直觀性，采用風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)最小的檢查方法。

本試驗(yàn)中收集了市面上6個(gè)藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的恩替卡韋分散片，覆蓋面廣，有一定代表性。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，制備1∶10的恩替卡韋分散片溶液呈乳白色混懸液，存在不溶性白色顆粒物，對(duì)菌落的回收試驗(yàn)產(chǎn)生干擾。選取的6個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的恩替卡韋分散片含量及溶出度均符合規(guī)定，但對(duì)細(xì)菌和酵母菌抑制力的不同，提示分散片不同的處方工藝對(duì)菌落可產(chǎn)生不同的抑制作用。將供試液進(jìn)一步稀釋成1∶20時(shí)，不溶性顆粒物對(duì)菌落回收的干擾大幅減少，6個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的恩替卡韋分散片對(duì)細(xì)菌和酵母菌的抑制作用均大幅減少，回收比值趨于穩(wěn)定，提示可通過(guò)提高供試液的稀釋級(jí)來(lái)降低藥品的抑菌作用。本試驗(yàn)中建立的恩替卡韋分散片微生物限度檢查方法，采用平皿法（傾注法）能真實(shí)、準(zhǔn)確、有效地反映藥品中污染存活的微生物。