CYP1B1基因多態(tài)性對(duì)前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)（BCR）預(yù)測價(jià)值的初步研究

顧成元 秦曉健 戴波 朱耀 朱煜 許 華 葉定偉

（復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科-復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系 上海 200032）

目前前列腺癌根治術(shù)是臨床局限性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但10年內(nèi)術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%［1］。前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）和病理指標(biāo)對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測特異度和敏感度較低［2］，臨床亟需能夠預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)記物，理想的生物標(biāo)志物將有助于對(duì)患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層進(jìn)行精準(zhǔn)輔助治療從而改善預(yù)后。

研究顯示雌激素通過氧化代謝在前列腺癌的進(jìn)展過程中起重要作用［3］。CYP1B1是一種在雌激素代謝羥基化過程中的關(guān)鍵酶。雌激素（如雌激素酮E1、雌二醇E2）可經(jīng)氧化代謝生成兒茶酚雌激素和雌激素醌，而CYP1B1催化兒茶酚雌激素生成致癌性4-OHE。這些氧化代謝產(chǎn)物具有DNA損傷效應(yīng)，導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生及持續(xù)進(jìn)展。CYP1B1蛋白表達(dá)量在前列腺癌組織中明顯高于良性前列腺增生組織［4］。

由于CYP1B1在雌激素代謝過程中的重要作用，CYP1B1基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）有可能通過改變基因表達(dá)水平影響前列腺癌進(jìn)展。目前尚無CYP1B1基因多態(tài)性與前列腺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)性研究。本研究旨在探索CYP1B1基因多態(tài)性對(duì)于前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性，評(píng)估其預(yù)測價(jià)值。

資料和方法

研究對(duì)象納入2006年至2009年間在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受前列腺癌根治術(shù)的426例局限性前列腺癌患者，中位隨訪時(shí)間37.7個(gè)月，術(shù)后每3個(gè)月隨訪PSA變化。將術(shù)后血清PSA水平連續(xù)兩次超過0.2 ng/mL定義為生化復(fù)發(fā)（biochemical recurrence，BCR）。臨床病理資料和隨訪信息通過電子病歷系統(tǒng)檢索獲得。排除術(shù)后接受輔助內(nèi)分泌或放療的患者。

候選SNP選擇及基因分型檢測利用人類基因組數(shù)據(jù)庫NCBI，查找CYP1B1基因，確定研究區(qū)域。通過HapMap數(shù)據(jù)庫查找本研究區(qū)域的SNP位點(diǎn)基因分型數(shù)據(jù)信息，獲取漢族人群中CYP1B1基因及其延伸區(qū)域內(nèi)所有SNP位點(diǎn)基因分型數(shù)據(jù)。將獲取的基因分型數(shù)據(jù)導(dǎo)入Haploview 4.2軟件，篩選出最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05的SNPs，導(dǎo)出連鎖不平衡圖譜及數(shù)據(jù)。通過對(duì)連鎖不平衡圖譜的數(shù)據(jù)比對(duì)，挑選出每個(gè)單倍域內(nèi)r2≥0.8且LOD＞3的SNPs，選取平均r2值最大的一個(gè)SNP作為該單倍域標(biāo)簽SNP。共確定8個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)（rs10916、rs162562、rs2551188、rs9341266、rs9341248、rs162549、rs1056827、rs1056836）。

基因分型檢測方法如文獻(xiàn)所述［5］。外周血樣本來自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫，采用德國Qiagen公司試劑盒，按照操作步驟提取全基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量，BioPhotometer核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）檢測DNA的濃度和純度，定量標(biāo)化至50 ng/μL，于4 ℃下分裝備用。采用TaqMan探針法進(jìn)行基因分型，即利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活力對(duì)探針本身進(jìn)行酶切，Taqman探針的兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和對(duì)應(yīng)的淬滅基團(tuán)。設(shè)計(jì)引物和探針定制于美國ABI公司。CYP1B1 rs1056836的引物序列F（5'-3'）：TGTCAACCAGTGGTCTGTGAATC，R：（5'-3'）TGGATCAAAGTTCTCCGGGTTA。探針序列（5'-3'）：ATGA-CCCAC/GTGAAGTG。反應(yīng)體系5 μL，包括1 μL DNA模板、0.125 μL引物探針、2.5 μL TaqMan Universal Master Mix以及1.375 μL去離 子水。在每 個(gè)384孔反應(yīng)板中設(shè)置陰性空白對(duì)照。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增之后用ABI PRISM 7900HT熒光定量PCR儀檢測熒光分布情況，并應(yīng)用SDS 2.4軟件進(jìn)行基因分型。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)和驗(yàn)證，基因型符合率為100%。

CYP1B1 mRNA檢測上述426例病例中，127例保存了前列腺癌旁組織樣本。按照Trizol試劑（美國Invitrogen公司）的說明提取總RNA。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，其中模板cDNA 1 μg，10×PCR緩沖液（15 mmol/L MgCl2）2.4 μL，Taq-DNA聚合酶1U，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，5 mmol/L上游引物和下游引物各l μL，加ddH2O至20 μL。依次預(yù)變性、變性、退火、延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物為GAPDH，452 bp；CYP1B1，297 bp。引物CYP1B1上游（5'-3'）：GCTGCAGTGGCTGCTCCT；下游（5'-3'）：CCCACGACCTGATCCAATTCT。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以表示，數(shù)值變量用非配對(duì)的t檢驗(yàn)，分類變量用χ2檢驗(yàn)。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，對(duì)可能的混雜因素（年齡、PSA、Gleason評(píng)分等）進(jìn)行調(diào)整，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）和95% 可信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI）來評(píng)估各種基因型與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法在顯性遺傳模式下進(jìn)行無復(fù)發(fā)生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析使用SAS 9.1軟件完成。

結(jié) 果

患者基線特征見表1。共426例患者，中位隨訪時(shí)間為37.7個(gè)月，其中100例術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)（23.5%）。全組患者1年無生化復(fù)發(fā)率為94.1%，3年無生化復(fù)發(fā)率為78.6%，其中57例接受內(nèi)分泌治療，43例接受挽救性放療聯(lián)合內(nèi)分泌治療。術(shù)前血清PSA、病理分期、淋巴結(jié)侵犯、Gleason評(píng)分與生化復(fù)發(fā)相關(guān)（P＜0.01）。

表1 研究對(duì)象的臨床病理特征Tab 1 Clinicopathologic characteristics of thestudy populations ［n（%）］

426例患者基因型分布見表2，對(duì)上述臨床病理特征進(jìn)行調(diào)整后分析顯示，8個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)CYP1B1 rs1056836與前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)相關(guān)（CG基因型，HR：0.65，95%CI：0.33～0.93，P=0.025），而其余7個(gè)SNP位點(diǎn)與前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)之間無關(guān)聯(lián)性，所以CYP1B1 rs1056836是獨(dú)立預(yù)后因素。

在顯性模型中，受突變基因影響并表現(xiàn)出性狀的定義為暴露組，即暴露于遺傳因素——rs1056836多態(tài)性中突變型G。因?yàn)槭秋@性模型，所以CG和GG都表現(xiàn)出突變性狀，CC為野生性狀。根據(jù)定義，CG/GG為暴露組，CC為非暴露組。本研究將CYP1B1 rs1056836中CC型與CG/GG型攜帶者兩者相比，CC基因型攜帶者術(shù)后進(jìn)展至生化復(fù)發(fā)時(shí)間較短，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，P=0.036）。

進(jìn)一步分析CYP1B1各SNP位點(diǎn)與mRNA表達(dá)的關(guān)系（圖2），與CG/GG基因型相比，rs1056836 CC基因型的CYP1B1 mRNA表達(dá)量顯著升高，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025），其余7個(gè)SNP位點(diǎn)與CYP1B1 mRNA表達(dá)量之間未見相關(guān)性。

表2 CYP1B1標(biāo)簽SNPs與前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的關(guān)系Tab 2 Associations between CYP1B1 tag SNPs and biochemical recurrence ［n（%）］

討 論

CYP1B1 rs1056836是位于外顯子3的非同義替換SNP，導(dǎo)致亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。之前關(guān)于CYP1B1基因多態(tài)性與前列腺癌關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，其研究終點(diǎn)為前列腺癌發(fā)病，但結(jié)果并不一致［6-8］。薈萃分析對(duì)這些研究進(jìn)行了總結(jié)，結(jié)果顯示在亞洲男性中rs1056836與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與C等位基因攜帶者相比，G等位基因攜帶者的前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為1.52倍（95%CI：1.20～1.92），但在高加索人群中并無關(guān)聯(lián)［9］。造成這一差異的原因可能有各種族基因型分布頻率不同、環(huán)境因素影響和前列腺癌發(fā)病率差異等。CYP1B1 rs1056836的等位基因頻率在不同的種族間具有顯著的差異，其中G等位基因在亞洲人群中的頻率約為16.76%，顯著低于高加索人群的38.66%，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）［10］。本研究首次以前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)為研究終點(diǎn)，在漢族人群中觀察CYP1B1基因多態(tài)性與前列腺癌的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，本組漢族人群中rs1056836基因頻率約為22.3%，低于既往文獻(xiàn)報(bào)道的G等位基因在高加索人群中的頻率。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)CYP1B1 rs1056836與前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)之間有關(guān)聯(lián)，CG基因型較CC基因型的生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（HR：0.65，95%CI：0.33～0.93，P=0.025）。

既往有研究觀察CYP1B1 rs1056836與前列腺癌侵襲性之間的關(guān)系，如Beuten等［11］納入393例高加索人，將Gleason評(píng)分≥7定義為高侵襲性前列腺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CYP1B1 rs1056836 CC基因型攜帶者相比，GG基因型攜帶者患高侵襲性前列腺癌的幾率降低約55%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR：0.45，95%CI：0.24～0.84，P=0.01）。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為CYP1B1可能在前列腺癌的進(jìn)展階段起關(guān)鍵作用，其表達(dá)升高后，CYP1B1可通過上調(diào)Sp1引起上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［12］。

已有研究報(bào)道CYP1B1 SNP位點(diǎn)通過改變雌激素正常生理代謝或表達(dá)水平可影響個(gè)體的腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。據(jù)此，本研究假設(shè)位于CYP1B1編碼區(qū)的rs1056836可能改變基因表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺癌的術(shù)后復(fù)發(fā)。隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)rs1056836確實(shí)與CYP1B1 mRNA表達(dá)相關(guān)。與正常前列腺細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞中CYP1B1的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高［13］。CYP1B1活性受到芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、內(nèi)源性雌激素和雌激素受體等多種機(jī)制調(diào)節(jié)。在侵襲性前列腺癌中AhR異常激活，CYP1B1催化雌激素氧化代謝生成兒茶酚雌激素和雌激素醌增多，最終導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移增加［14］。

本研究存在一定的局限性，如病例數(shù)和隨訪時(shí)間相對(duì)有限，缺乏蛋白水平的驗(yàn)證，具體的生物學(xué)機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)CYP1B1編碼區(qū)SNP rs1056836與前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，CC基因型攜帶者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。對(duì)于行前列腺癌根治術(shù)的患者進(jìn)行該位點(diǎn)的基因分型有助于判斷復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，臨床上可針對(duì)高危患者積極采取輔助治療以改善預(yù)后。