懷牛膝飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及指紋圖譜研究

王小燕 常軍民 郭常潤(rùn) 陳麗

摘 要 目的：建立懷牛膝飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)并建立不同產(chǎn)地飲片的指紋圖譜。方法：采用薄層色譜法（TLC）鑒別懷牛膝飲片;按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）方法檢查懷牛膝飲片的水分、總灰分、醇溶性浸出物的含量;采用紫外分光光度法測(cè)定總甾酮的含量;采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定β-蛻皮甾酮的含量;采用HPLC法建立10批懷牛膝飲片的指紋圖譜，以β-蛻皮甾酮（10號(hào)峰）為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰;采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行聚類分析、主成分分析以評(píng)價(jià)懷牛膝飲片的綜合質(zhì)量。結(jié)果：TLC鑒別結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與β-蛻皮甾酮、人參皂苷Ro對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有相同顏色的斑點(diǎn)。10批懷牛膝飲片的平均水分含量為4.07%～6.33%，總灰分含量為5.04%～6.43%，醇溶性浸出物含量為6.57%～11.12%。總甾酮（以β-蛻皮甾酮計(jì)）、β-蛻皮甾酮檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.01～0.08、68.5～479.5 ?g/mL（R2均大于0.999），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%，平均加樣回收率分別為98.85%（RSD=1.89%，n=6）、100.34%（RSD=2.12%，n=9），平均含量分別為0.34%～0.56%、0.07%～0.09%。10批懷牛膝飲片共有24個(gè)共有峰，相似度均大于0.900。聚類分析結(jié)果顯示，10批懷牛膝飲片可聚為4類，其中S1、S3、S6、S10為一類，S2、S7、S8為一類，S4、S9 為一類，S5為一類。主成分分析結(jié)果顯示，前4個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為86.774%。綜合質(zhì)量高低依次為S8>S5>S9>S4>S3>S7>S6>S10>S2>S1。結(jié)論：所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、含量測(cè)定方法和HPLC指紋圖譜穩(wěn)定、準(zhǔn)確性好，可用于全面評(píng)價(jià)懷牛膝飲片的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 懷牛膝飲片;薄層色譜法;高效液相色譜法;含量測(cè)定;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析

ABSTRACT ? OBJECTIVE： The establish the quality standard of Achyranthes bidentata decoction pieces and establish the fingerprint of decoction pieces of different origins. METHODS： TLC method was used to identify A. bidentata decoction pieces. The contents of water， total ash and ethanol-soluble extract in A. bidentata decoction pieces were determined according to the method in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）. UV spectrophotometry was used to determine the content of total steroid. The content of β-ecdysterone in A. bidentata decoction pieces was determined by HPLC. HPLC method was used to establish the fingerprint of 10 batches of A. bidentata decoction pieces. Using β-ecdysterone （No. 10 peak） as reference， similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprints （2012 edition）， and the common peaks were determined. SPSS 21.0 software was used for cluster analysis and principal component analysis so as to evaluate the comprehensive quality of A. bidentata decoction pieces. RESULTS： Results of TLC identification showed that the spots with the same color on the corresponding positions of β-ecdysterone and ginsenoside Ro control in chromatogram of test sample. The average water content of 10 batches of A. bidentata decoction pieces was 4.07%-6.33%. The total ash content was 5.04%-6.43%. The ethanol-soluble extract was 6.57%-11.12%. The linear range of total sterone （by β-ecdysterone） and β-ecdysterone were 0.01-0.08 mg/mL and 68.5-479.5 ?g/mL （R2>0.999）， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 3%. The average recovery rates were 98.85%（RSD=1.89%，n=6） and 100.34%（RSD=2.12%，n=9）， respectively. The average contents were 0.34%-0.56% and 0.07%-0.09%， respectively. There were 24 common peaks in 10 batches of A. bidentata decoction pieces， and the similarity was all over 0.900. Cluster analysis results showed that 10 batches of A. bidentata decoction pieces could be grouped into 4 categories， among which S1， S3， S6 and S10 were one category， S2， S7 and S8 were one category， S4 and S9 were one category， and S5 was one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of the first four principal components was 86.774%. The order of comprehensive quality is S8>S5>S9>S4>S3>S7>S6>S10>S2>S1. CONCLUSIONS： The established quality standard， content determination method and HPLC fingerprint are stable and accurate， and can be used for the quality evaluation of A. bidentata decoction pieces.

KEYWORDS ? Achyranthes bidentata decoction pieces; TLC; HPLC; Content determination; Fingerprint; Cluster analysis; Principal component analysis

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，其性平，味苦、甘、酸，具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效，常用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無(wú)力等[1]。牛膝主產(chǎn)于我國(guó)河南、河北、山東、山西、內(nèi)蒙、安徽等地，其中河南焦作的武陟、溫縣、博愛(ài)、沁陽(yáng)以及新鄉(xiāng)的輝縣等地所種植的牛膝又被稱為懷牛膝[2]，已成為道地藥材品種“四大懷藥”之一[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，懷牛膝除含有皂苷類、甾酮類、多糖類等主要化學(xué)成分外，還含有少量生物堿類、黃酮類成分[4]。甾酮類成分具有促進(jìn)骨質(zhì)增生、調(diào)節(jié)糖代謝、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[5];β-蛻皮甾酮作為該藥材主要的甾酮類成分之一，具有抑制破骨細(xì)胞分化、促成骨樣細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，抑制由藥物引起的血糖升高和降膽固醇的作用，與牛膝“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”功效相吻合[6-7]。

中藥飲片是指基于中醫(yī)藥理論，依據(jù)藥物效用、應(yīng)用方式，對(duì)藥材進(jìn)行炮制處理，使其變成具備一定規(guī)格及形狀的成品[8]。目前，關(guān)于懷牛膝質(zhì)量控制的研究主要集中于原藥材的含量測(cè)定和指紋圖譜研究方面[7，9-10]，關(guān)于飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究較少;加之中藥飲片的質(zhì)量檢測(cè)基本上還沿襲傳統(tǒng)的飲片檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，其檢驗(yàn)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，僅通過(guò)外觀、氣味、口嘗等方式檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥飲片有效成分及整體質(zhì)量的評(píng)價(jià)[11]。指紋圖譜是目前中藥飲片質(zhì)量控制的有效手段，可全面反映中藥飲片炮制前后的變化，能有效控制中藥飲片的質(zhì)量，具有特征性和整體性[11]。目前，關(guān)于懷牛膝飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少且不全面，仇立志[12]僅探討了硫磺熏蒸對(duì)懷牛膝飲片質(zhì)量的影響;王博等[13]雖然采用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同廠家懷牛膝飲片進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，但缺乏詳細(xì)的分析，信息量有限。為此，本研究采用薄層鑒別法（TLC）對(duì)懷牛膝飲片進(jìn)行鑒別，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）方法對(duì)其水分、總灰分、醇溶性浸出物等進(jìn)行考察;采用紫外分光光度法（UV）測(cè)定總甾酮含量，采用HPLC法測(cè)定β-蛻皮甾酮含量;同時(shí)建立懷牛膝飲片的指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析，旨在為懷牛膝飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善和總體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1800 PC型UV計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）;1260型HPLC儀，包括G1312C型雙元泵、G1329B型檢測(cè)器、G1316A型柱溫箱、G1315D型進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）;QE-300型萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）;DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;BSA124S型電子天平[賽多利斯科技儀器（北京）有限公司];SX2型箱式電阻爐（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）;KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;硅膠G薄層板（粒徑：10～40 ?m;青島海洋化工有限公司）;D101型大孔吸附樹(shù)脂[粒徑范圍：（0.3～1.25）mm≥95%;蚌埠市天星樹(shù)脂有限責(zé)任公司]。

1.2 藥品與試劑

β-蛻皮甾酮對(duì)照品（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：111903-201805，純度：≥98%）;人參皂苷Ro對(duì)照品（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：111638- 201907，純度：≥98%）;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。10批懷牛膝飲片（編號(hào)：S1～ S10），經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院楊中林教授鑒定為莧科植物牛膝A. bidentata Bl.的干燥根（去蘆頭后潤(rùn)軟，切3 mm厚片，低溫烘干[10]后，將樣品粉碎，過(guò)40目篩，粉末密封于自封袋中，置于干燥器內(nèi)保存于中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院）。樣品信息來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

取各批樣品粉末約4 g，加入80%甲醇50 mL，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz，下同）提取2次，每次30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL，微熱（30 ℃）使溶解，過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑：1.5 cm，柱高：15 cm），依次用水100 mL、20%乙醇100 mL、80%乙醇100 mL洗脫，收集80%乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取β-蛻皮甾酮對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每l mL含1 mg的單一對(duì)照品溶液;以甲醇作為陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0502薄層色譜法”[14-15]，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7 ∶ 3 ∶ 0.5 ∶ 0.05，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，在供試品色譜中，與β-蛻皮甾酮、人參皂苷Ro對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有相同顏色的斑點(diǎn)且陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

2.2 水分、總灰分、醇溶性浸出物的含量測(cè)定

水分、總灰分和醇溶性浸出物的測(cè)定分別按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0832水分測(cè)定法烘干法”“2302灰分測(cè)定法”“2201醇溶性浸出物測(cè)定法”（以水飽和的正丁醇作溶劑）[15]測(cè)定，每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，水分含量為4.07%～6.33%，平均值為5.27%;總灰分含量為5.04%～6.43%，平均值為5.63%;醇溶性浸出物含量為6.57%～11.12%，平均值為8.78%，詳見(jiàn)表2。

2.3 總甾酮的含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備 取樣品粉末約1 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加80%乙醇50 mL，超聲提取 2 次，每次 1 h，濾過(guò)，收集濾液，水?。?5 ℃）加熱濃縮至無(wú)醇味，過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑：1.2 cm，柱高：10 cm），依次用水50 mL、5%乙醇30 mL、80%乙醇50 mL洗脫，收集80%乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状枷♂尣⒍ㄈ葜?5 mL，即得[7]。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品5.01 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，制得質(zhì)量濃度為0.501 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取上述供試品溶液（編號(hào)：S4）、對(duì)照品溶液各0.2 mL，分別置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻;另取甲醇為空白對(duì)照溶液。分別于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果，對(duì)照品溶液與供試品溶液均在243 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇243 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)（圖略）。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.45、0.55、0.60、0.65、0.70、0.80 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，于243 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，β-蛻皮甾酮的回歸方程為Y=25.74X-0.036（R 2=0.999 2），表明β-蛻皮甾酮檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.01～0.08 mg/mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，于243 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定吸光度6次。結(jié)果，β-蛻皮甾酮吸光度的RSD 為 0.57%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（編號(hào)：S4）粉末，約1 g，共6份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于243 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，β-蛻皮甾酮含量的RSD為0.02%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，分別于室溫下放置0、1、2、3、4、5 h時(shí)于243 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，β-蛻皮甾酮吸光度的RSD 為 0.55%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（編號(hào)：S4）粉末，約 0.5 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，加入0.572 mg/mL對(duì)照品溶液（精密稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品5.72 mg，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制得）4.2 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于243 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，總甾酮的平均加樣回收率為98.85%（RSD=1.89%，n=6）。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取10批樣品粉末適量，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，于243 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。每樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果，10批樣品中總甾酮的平均含量（以β-蛻皮甾酮計(jì)）分別為0.50%、0.37%、0.56%、0.34%、0.38%、0.50%、0.34%、0.47%、0.41%、0.52%。

2.4 β-蛻皮甾酮的含量測(cè)定

2.4.1 供試品溶液的制備 取樣品粉末約 1 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入水飽和的正丁醇 40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡過(guò)夜，超聲處理 45 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，用甲醇 10 mL 分?jǐn)?shù)次洗滌容器及殘?jiān)?，合并濾液和洗液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，移? mL量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得[11]。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品2.74 mg，置于2 mL量瓶中，用甲醇定容，混勻，制得質(zhì)量濃度為1.37 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.4.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～13 min，5%A→23%A;13～20 min，23%A→25%A;20～26 min，25%A→26%A;26～37 min，26%A→50%A;37～52 min，50%A→73%A;52～54 min，73%A→87%A;54～60 min，87%A→95%A;60～65 min，95%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液和空白溶液（甲醇）各適量，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，β-蛻皮甾酮的理論板數(shù)大于6 000，與鄰峰基線分離，分離度大于1.5，且空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾（圖略）。

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mL，置于1 mL量瓶中，加甲醇定容，混勻，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以β-蛻皮甾酮質(zhì)量濃度（X，?g/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，β-蛻皮甾酮的回歸方程為Y=17.12X-310.9（R 2=0.999 0），表明β-蛻皮甾酮檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為68.5～479.5 ?g/mL。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S10）適量，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為1.00%（n=6），表明方法精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（編號(hào)：S10）粉末，約1 g，共6份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，β-蛻皮甾酮含量的RSD為0.87%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S10）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為0.83%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（編號(hào)：S10）粉末，約1 g，共9份，精密稱定，按已知量的50%、100%、150%加入“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，β-蛻皮甾酮的平均加樣回收率為100.34%（RSD=2.12%，n=9）。

2.4.10 β-蛻皮甾酮的含量測(cè)定 取10批樣品粉末適量，約1 g，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，平行測(cè)定3次。結(jié)果，10批樣品中β-蛻皮甾酮的平均含量分別為0.07%、0.07%、0.08%、0.08%、0.08%、0.08%、0.08%、0.09%、0.08%、0.07%。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 供試品溶液的制備 同“2.4.1”項(xiàng)。

2.5.2 色譜條件 同“2.4.3”項(xiàng)。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.5.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4），按“2.5.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。以β-蛻皮甾酮（10號(hào)峰）為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，24個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（編號(hào)：S4）粉末，約 1 g，共6份，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以β-蛻皮甾酮為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，24個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.5.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以β-蛻皮甾酮為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，24個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 指紋圖譜的生成 取10批樣品粉末，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將所得圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以S1為參照?qǐng)D譜（S1樣品中各色峰分離度良好且對(duì)應(yīng)峰面積穩(wěn)定），采用中位數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1，進(jìn)行多點(diǎn)校正和標(biāo)記峰（Mark峰）匹配[13]，得到HPLC疊加指紋圖譜、對(duì)照指紋圖譜、對(duì)照品溶液的HPLC圖，詳見(jiàn)圖2～圖4。結(jié)果，10批樣品共有共有峰24個(gè)。

2.5.7 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）》對(duì)10批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，10批樣品的相似度分別為0.995、0.991、0.987、0.979、0.969、0.997、0.983、0.975、0.998、0.990，表明10批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度較高，總體化學(xué)成分差異較小。

2.5.8 共有峰的指認(rèn) 本研究前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，懷牛膝飲片中β-蛻皮甾酮含量較高，且出峰穩(wěn)定，分離度較好，故以其為參照（s），計(jì)算其余各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間（圖4）對(duì)比，指認(rèn)10號(hào)峰為β-蛻皮甾酮。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表3、表4。

2.6 聚類分析

以10批樣品的24個(gè)共有峰峰面積為變量，采用SPSS 21.0軟件對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用組間聯(lián)接，以平方Euclidean距離為測(cè)度進(jìn)行聚類分析。結(jié)果，10批樣品可聚為4類，其中S1、S3、S6、S10為一類，S2、S7、S8為一類，S4、S9 為一類，S5為一類，詳見(jiàn)圖5。

2.7 主成分分析

采用 SPSS 21.0軟件對(duì)樣品中15 個(gè)共有峰（6～12、15～16、18～23號(hào)峰，剔除溶劑峰以及峰面積較小的不穩(wěn)定峰對(duì)于分析結(jié)果的影響）峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，進(jìn)行主成分分析（以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)[16-17]）。結(jié)果，得到4個(gè)主成分因子，累積方差貢獻(xiàn)率為86.774%>80%，即這4個(gè)主成分因子能反映樣品80%以上的質(zhì)量信息，故以這4個(gè)主成分因子為指標(biāo)，對(duì)10批樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表5。

為了使提取的4個(gè)主成分能更加清晰、全面地反映原始數(shù)據(jù)所包含的信息，本研究以最大方差法對(duì)變量進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)，得到旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣（表6）;同時(shí)以4個(gè)主成分因子為變量，繪制主成分分析碎石圖（圖6）和得分圖（圖7）。結(jié)果，除16、20號(hào)峰外，其余共有峰在主成分1中有明顯的正載荷;除8、9、21、22、23號(hào)峰外，其余共有峰在主成分2中有明顯的正載荷;除12、21、22、23號(hào)峰外，其余共有峰在主成分3中有明顯的正載荷;除16、19、20、21、22、23號(hào)峰外，其余共有峰在主成分4中有明顯的正載荷;10批樣品分為4類，其中S5為一類，S1、S3、S6、S10為一類，S2、S7、S8為一類，S4、S9為一類，與“2.6”項(xiàng)下聚類分析結(jié)果一致（F為各色譜峰峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)）。

2.8 質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)

以X1、X2、X3、X4分別代表“2.7”項(xiàng)下提取的4個(gè)主成分，根據(jù)表6結(jié)果，得各主成分得分為X1=0.043F1+0.308F2+0.247F3+0.089F4+0.965F5+0.876F6+0.929F7+0.059F8-0.264F9+0.106F10+0.064F11-0.181F12+0.755F13+0.764F14+0.117F15;X2=0.859F1+0.789F2-0.038F3-0.063F4+0.057F5+0.261F6+0.094F7+0.374F8+0.190F9+0.873F10+0.760F11+0.835F12-0.350F13-0.015F14-0.127F15;X3=0.069F1+0.285F2+0.675F3+0.161F4+0.043F5+0.019F6-0.260F7+0.870F8+0.923F9+0.344F10+0.022F11+0.196F12-0.098F13-0.060F14-0.638F15;X4=0.061F1+0.312F2+0.649F3+0.952F4+0.149F5+0.326F6+0.059F7+0.084F8-0.050F9+0.177F10-0.376F11-0.152F12-0.500F13-0.574F14-0.179F15。同時(shí)，根據(jù)表5結(jié)果，得綜合得分（x）=（33.124X1+27.330X2+17.081X3+9.239X4）/86.774，綜合得分越高表示樣品整體質(zhì)量越好[18]，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，S8樣品綜合得分最高，S1樣品最低，提示不同廠家由于炮制方式不同，其飲片質(zhì)量存在差異。

3 討論

本研究前期試驗(yàn)分別考察了回流和超聲提取對(duì)TLC斑點(diǎn)的影響，結(jié)果，兩種方法均呈現(xiàn)清晰的斑點(diǎn);隨后，進(jìn)一步考察了兩種方法對(duì)待測(cè)成分HPLC色譜峰的影響，結(jié)果，超聲提取樣品的色譜峰峰形好、響應(yīng)強(qiáng)且雜質(zhì)干擾少，故選擇超聲提取。同時(shí)，本研究考察了不同料液比（1 ∶ 15、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40、1 ∶ 45、1 ∶ 60，g/mL，下同）、超聲提取時(shí)間（30、45、60 min）對(duì)待測(cè)成分峰面積的影響。結(jié)果，當(dāng)料液比為1 ∶ 40時(shí)，β-蛻皮甾酮峰面積最大;但增加料液比，其峰面積下降，故選擇料液比為1 ∶ 40。當(dāng)超聲45 min時(shí)，β-蛻皮甾酮峰面積最大，故選擇超聲時(shí)間為45 min。此外，對(duì)不同流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）、色譜柱（Intertsil C18、Syncronis C18、Hedera ODS-2）進(jìn)行考察，結(jié)果，采用“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件時(shí)，待測(cè)物色譜峰峰形對(duì)稱、分離度良好且響應(yīng)較強(qiáng)。

基于中藥多組分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，影響其質(zhì)量的因素除藥材飲片原料復(fù)雜外，還有炮制工藝，這使得“一品多家”的情況十分普遍?？梢?jiàn)，建立揭示不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量差異的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)更有利于區(qū)分產(chǎn)品的優(yōu)劣[19]。本研究在TLC鑒別的基礎(chǔ)上，對(duì)10批不同廠家懷牛膝飲片的水分、總灰分及醇溶性浸出物、總甾酮、β-蛻皮甾酮的含量進(jìn)行測(cè)定，采用定性、定量結(jié)合指紋圖譜對(duì)懷牛膝飲片進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，10批樣品中水分含量為4.07%～6.33%，總灰分含量為5.04%～6.43%，醇溶性浸出物含量為6.57%～11.12%，總甾酮（以β-蛻皮甾酮計(jì)）含量為0.34%～0.56%，β-蛻皮甾酮含量為0.07%～0.09%，提示不同廠家樣品質(zhì)量存在差異。本研究采用UV法檢測(cè)樣品中總甾酮的含量（β-蛻皮甾酮計(jì)），目的是為了確定牛膝飲片中大類成分（甾酮類）的含量;采用HPLC法檢測(cè)β-蛻皮甾酮的含量，是由于該化物在甾酮類成分中含量較高，且出峰穩(wěn)定，是甾酮類成分中的主要成分。雖然均以β-蛻皮甾酮為指標(biāo)，但由于采用的檢測(cè)方法不同，檢出的目標(biāo)組分不同，因此并不沖突。

本研究結(jié)果顯示，10批樣品共有24個(gè)共有峰，相似度均大于0.900，并指認(rèn)了10號(hào)峰為β-蛻皮甾酮。聚類分析結(jié)果顯示，10批樣品可聚為4類，其中S1、S3、S6、S10為一類，S2、S7、S8為一類，S4、S9 為一類，S5為一類，這可能與原藥材的生長(zhǎng)環(huán)境及不同廠家飲片的炮制加工工藝不同有關(guān)[20]。主成分分析結(jié)果與上述結(jié)果一致。綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，S8>S5>S9>S4>S3>S7>S6>S10>S2>S1，提示不同廠家懷牛膝飲片質(zhì)量有一定差異，這可能是由于炮制方式不同（即使同一炮制品，在輔料用量、炒制溫度、炒制時(shí)間和炮制程度判定方面也有差異[21]）或者采購(gòu)的原藥材質(zhì)量存在差異。

綜上所述，所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、含量測(cè)定方法和HPLC指紋圖譜穩(wěn)定、準(zhǔn)確性好，可用于全面評(píng)價(jià)懷牛膝飲片的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：72.

[ 2 ] 屠萬(wàn)倩，張留記，劉曉苗，等.懷牛膝及其炮制品中甾酮類和皂苷類成分的含量比較[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（1）：89-93.

[ 3 ] 張留記，劉曉苗，屠萬(wàn)倩，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定懷牛膝中5個(gè)成分的含量[J].藥物分析雜志，2018，38（4）：623- 629.

[ 4 ] 付國(guó)輝，陳隨清，劉嘉，等.牛膝化學(xué)成分及等級(jí)分類研究[J].海峽藥學(xué)，2018，30（2）：29-32.

[ 5 ] 鄭義哲，劉本.牛膝中植物甾酮類成分的研究進(jìn)展[J].科技通報(bào)，2008，24（6）：820-826.

[ 6 ] 孟大利，李銳.中藥牛膝化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2001，11（2）：120-124.

[ 7 ] 張留記，孫丹丹，屠萬(wàn)倩，等.不同產(chǎn)地懷牛膝β-蛻皮甾酮含量測(cè)定及指紋圖譜研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25（4）：500-505、510.

[ 8 ] 趙俠.中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究現(xiàn)狀及相關(guān)思考[J].大家健康：中旬版，2013，7（4）：77-78.

[ 9 ] 紀(jì)亮，劉倩茹，梁獻(xiàn)葵，等.不同規(guī)格懷牛膝不同極性部位HPLC指紋圖譜[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2020，55（8）：580- 587.

[10] 唐維維，梁獻(xiàn)葵，馬馳虹，等.不同采收季節(jié)懷牛膝指紋圖譜研究[J].中藥材，2019，42（9）：2079-2085.

[11] 蔡皓，秦昆明，劉曉，等.中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究現(xiàn)狀及相關(guān)思考[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（3）：450-456.

[12] 仇立志.硫磺熏蒸對(duì)懷牛膝飲片質(zhì)量的相關(guān)性評(píng)價(jià)[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[13] 王博，孟嘯龍，徐寧，等.基于HPLC指紋圖譜技術(shù)的不同廠家懷牛膝飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（6）：1364-1367.

[14] 杜星，郭東艷，史傳道.抗疏健骨顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（6）：97-101.

[15] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57-58、104、202、204-206、224-225.

[16] 馮華，王祥培，王世俊，等.辣椒藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（8）：1078-1082.

[17] 黃華花，王明軍，黃鳴清，等.金橘藥材的UPLC指紋圖譜建立、聚類分析及主成分分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（12）：1661-1665.

[18] 何微微，晉玲，王莉.不同包裝、儲(chǔ)藏處理羌活飲片的UPLC指紋圖譜[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（6）：144-151.

[19] 王曉偉，王艷偉，王海波，等.香砂和中丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（2）：153-159.

[20] 楊俊杰，張振凌.中藥材產(chǎn)地加工與道地藥材相關(guān)性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（5）：676-677.

[21] 王清浩，王云，張雪，等.黨參產(chǎn)地加工及炮制研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（22）：206-214.

（收稿日期：2020-08-22 修回日期：2020-11-04）

（編輯：陳 宏）