• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    廣東省千燈湖擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)的形態(tài)和產毒能力的株間差異及系統(tǒng)進化*

    2020-01-09 09:05:36雷敏婷葉金梅雷臘梅韓博平
    湖泊科學 2020年1期
    關鍵詞:藻株產毒進化樹

    路 琰,雷敏婷,葉金梅,雷臘梅,韓博平

    (暨南大學生命科學技術學院生態(tài)學系,廣州 510632)

    擬柱孢藻是熱帶和亞熱帶常見的水華藻類之一,具有較強的入侵能力和產毒能力. 產CYN的擬柱孢藻于1979年在澳大利亞Palm島首次被發(fā)現,致使148人中毒,引起嘔吐、厭食和肝腫大等癥狀[1]. 擬柱孢藻毒素是一類環(huán)胍類生物堿[2],對小鼠具急性毒性,腹腔注射小鼠的LD50為2.1 mg/kg[2]. 研究表明,CYN具有肝毒性,神經毒性和細胞毒性,能夠抑制谷胱甘肽、細胞色素P450和蛋白質的合成,是一種潛在的致癌物[3-5]. Humpage等[6]以 CYN 每日最低可見有害作用水平 30 μg/kg為基準,建議飲用水中的濃度限值為1 μg/L. 目前在澳大利亞[7]、新西蘭[8]、東亞、東南亞以及沙特阿拉伯[9-11]等地區(qū)都發(fā)現了能夠產CYN的擬柱孢藻. Mihali 等首次在C.raciborskiiAWT205藻株中揭示了擬柱孢藻毒素合成酶基因簇的分子特征[12]. 該基因簇全長43 kb,共包含15個開放閱讀框:脒基轉移酶基因cyrA,PKS/NRPS基因cyrB、cyrC、cyrD、cyrF和cyrE,尿嘧啶環(huán)形成基因cyrG和cyrH,裁剪酶基因cyrI、cyrJ和cyrN,運輸基因cyrK,調控基因cyrO,轉座酶基因cyrL和cyrM. 而基于產毒基因的分子技術具有簡單、快速、靈敏等優(yōu)點,已廣泛應用于藍藻毒素的相關研究,在檢測擬柱孢藻的產毒潛能中也逐步得到應用[13].

    研究認為擬柱孢藻的成功侵入性主要是由于其能夠耐受多種環(huán)境條件,如低光照,低溫和低營養(yǎng)可利用性[7]. 此外,Bonilla等也將其生態(tài)成功歸因于高的表型可塑性[14],這種可塑性實際上來源于多個生態(tài)型(即藻株)的存在,而每個生態(tài)型都有自己的最佳生理需求[15]. 即使是分離自同一水體的兩株擬柱孢藻同樣在形態(tài)、藻絲體長度、生長、光照以及溫度和營養(yǎng)鹽等方面存在差異[16]. 擬柱孢藻的各個株系并不都產毒,產毒和非產毒株系往往在形態(tài)上沒有差別,但兩者在遺傳特征和生理特性上差異較大,此外產毒藻株間也有毒性強弱和毒素種類不同之分[10,17-18]. 擬柱孢藻藻株間的差異反映了其高度適應性的策略,推測這也是擬柱孢藻能夠快速地理擴張的主要驅動力[7].

    藍藻的分子生物學研究起始于1960s,并被廣泛應用于藍藻分子系統(tǒng)學的研究,隨后形成了一門新興學科藻類分子系統(tǒng)學. 運用于藍藻系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標記包括16S rDNA、16S~23S rRNA 基因間隔序列(ITS)和RNA聚合酶rpoC等[19]. 由此可見,系統(tǒng)進化樹是描述某物種進化歷史的重要形式. 關于擬柱孢藻的發(fā)生和擴散主要有兩種假說,第1種假說認為擬柱孢藻的擴散存在非洲和澳大利亞兩個擴散中心[20];第2種假說則認為擬柱孢藻對溫帶地區(qū)的入侵不是來自于非洲或澳大利亞,而是每個大陸的溫暖避難區(qū)[21],即擬柱孢藻是從較溫暖的避難地區(qū)向美洲和歐洲擴散[22]. 但最近有研究對上述兩個假說均提出質疑,Cirés等根據cpcBA-IGS和nifH基因共建系統(tǒng)進化樹,結果發(fā)現西班牙的藻株與美洲的擬柱孢藻藻株聚在一起,明顯與歐洲其他藻株分開[23],而以前的研究一直認為西班牙藻株是歐洲-亞洲組的一部分,這表明現有的擬柱孢藻系統(tǒng)地理學和擴散途徑的假設還有待進一步驗證. Manthos等在對希臘的擬柱孢藻藻株進行了系統(tǒng)進化分析提出南美和非洲兩個輻射中心,南美輻射中心隨后向南美、突尼斯、希臘或西班牙擴張,非洲輻射中心導致了擬柱孢藻從非洲到澳大利亞,然后再向亞洲和歐洲的擴張[24],它為擬柱孢藻的全球擴散提供了一種新的解釋.

    我國是世界上水體富營養(yǎng)化最嚴重的國家之一,擬柱孢藻已在多個省份分布,如廣東省、福建省、云南省、湖北省、臺灣省、山東省和北京等[10-11,25-27]. 尤其在南亞熱帶地區(qū),擬柱孢藻已逐漸取代微囊藻成為水體的優(yōu)勢種群[28],但關于該地區(qū)擬柱孢藻產毒特征的研究幾乎空白. 本研究以從廣東省千燈湖分離的10株擬柱孢藻為材料,觀察了它們的基本形態(tài)特征,采用基于多個CYN毒素合成酶基因的PCR檢測和LC-MS/MS對藻株的產毒能力進行了聯合分析,并構建了rpoC1和nifH雙基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹. 本研究可初步了解南亞熱帶地區(qū)擬柱孢藻的產毒特征和進化起源,為擬柱孢藻水華的風險評估提供參考.

    1 材料和方法

    1.1 藻株的分離與形態(tài)觀察

    千燈湖(23°2′59″N,113°8′29″E)位于廣東省佛山市,總庫容為5.6×105m3,平均水深2 m,屬于亞熱帶海洋性季風氣候,夏季高溫多雨,冬季溫和少雨,為小型景觀湖泊. 水樣于2017年9月-2018年2月期間每月采集一次,藻株的分離方法為使用玻璃毛細管在顯微鏡下吸取單根藻絲體,在無菌水滴中沖洗5~6次,轉移到含有1 mL WC培養(yǎng)基的24孔細胞培養(yǎng)板中. 培養(yǎng)溫度為25 ± 1℃,光照強度為35 μmol / (m2·s),光周期為12 h∶12 h. 20 d左右使用OLYMPUS TH4-200倒置顯微鏡鏡檢,將分離成功的藻株轉移至50 mL 錐形瓶中繼續(xù)擴大培養(yǎng),共計分離出10株擬柱孢藻,命名為QDH1~QDH10.

    為觀察10 株擬柱孢藻生長和形態(tài)差異,在50 mL Pyrex 玻璃管中加入35 mL藻液,每藻株設置3個重復, 使用TD-700 葉綠素熒光儀測定葉綠素a(Chl.a)濃度,培養(yǎng)至第15天時每個樣本取2 mL藻液用魯哥試劑固定,在10×40倍顯微鏡(ZEISS AX10)下,記錄50根藻絲的長度和寬度以及異形胞的形態(tài)、長度和寬度. 同時采用針對16S rDNA設計的藍藻特異性引物對27FW和809R(表1)進行PCR擴增,PCR產物送往公司測序,獲得的序列采用BLAST進行相似性分析. 比生長速率μ(d-1)指在某一段時間間隔內藻類的生長速率,計算公式[29]為:

    μ=[ln(x2)-ln(x1)]/(t2-t1)

    (1)

    式中,x1為t1時的生物量,x2為t2時的生物量,此處均為Chl.a濃度,μg/L. 而t1、t2分別為擬柱孢藻指數生長期的第1天和第7天.

    藻絲體的長寬比和比生長率差異采用多重比較分析(Least-significant difference,LSD). 所有統(tǒng)計分析和圖形繪制在SPSS 22.0和OriginPro 8.0軟件中完成.

    1.2 產毒基因的PCR擴增

    選取擬柱孢藻毒素合成酶基因簇中的cyrA、cyrB、cyrC、cyrJ、pks和ps共6個基因,表1列舉了6個基因的特異性引物序列和來源. 擬柱孢藻基因組DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)提取,PCR反應體系總體積為30 μL,包括:2×HieffTMPCR Master Mix 15 μL,引物各0.5 μL,DNA模板3 μL,用無菌水補充體積. PCR反應在UNOII Biometra PCR儀上進行,擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳,SYRB染色,BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測,將有單一目標條帶的PCR產物送往公司測序,獲得的序列采用BLAST進行相似性分析.

    表1 用于PCR擴增的16S rDNA、rpoC1、nifH基因和產毒基因的引物信息

    1.3 CYN的LC-MS/MS分析

    取2 mL新鮮培養(yǎng)的擬柱孢藻藻液,離心后去上清,將藻細胞浸于純凈水中,冰浴下用超聲波破碎儀破碎細胞,離心后收集上清,-20℃保存?zhèn)溆? 上清中CYN的分析采用 AB SCIEX API 3200TMLC/MS/MS系統(tǒng),以純度為95%的CYN(Enzo life science)作為標準品. 采集軟件為Analyst 1.6.2,離子源為ESI源,采用多反應監(jiān)測(MRM)正離子模式,CYN的定量離子對為416.2/194.3和416.2/176.3,deoxy-CYN的離子對為400.2/194.3和400.2/176.3. 色譜柱為安捷倫Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×50 mm,2.7 μm),柱溫為40℃,進樣量為20 μL. 液相色譜采用梯度模式洗脫,流速0.6 mL/min,流動相為5%的乙腈. 由于deoxy-CYN沒有市售的標準品,它的定量根據CYN的標準曲線來計算.

    1.4 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

    rpoC1基因是藍藻中編碼RNA聚合酶3個最大亞單位的基因,nifH基因是固氮酶基因,是目前擬柱孢藻系統(tǒng)進化研究中最常使用的基因序列. 用10株千燈湖擬柱孢藻的nifH和rpoC1序列與從 GenBank 數據庫下載的同源序列構建系統(tǒng)樹,兩株念珠藻作為外類群,所用藻株的信息和來源見附表1. 采用MEAGE6.0對42株藻的nifH基因序列與rpoC1基因序列進行比對,刪除首尾多余序列,將截取出來的序列保存. 隨后手動將同一株藻的兩個基因序列在Notepad++文本軟件包中進行串聯,串聯序列長度為628 bp. 以串聯序列為材料利用iqtree軟件包構建系統(tǒng)發(fā)育樹,程序中的ModelFinder模塊自動計算出最大似然法(ML)的最佳擬合進化模型為GTR+F+G4模型. 系統(tǒng)樹各分支的置信度由重復抽樣法(Bootstrap)1000 次重復檢測. 同時使用MEGA6.0構建最大簡約(MP)進化樹,以確定進化樹的可靠性. 進化樹的編輯器使用iTOL的在線版本,鏈接為https://itol.embl.de/upload.cgi.

    2 結果

    2.1 擬柱孢藻的形態(tài)和生長特性

    將測序所獲得的QDH系列藻株的16S rDNA基因序列與GeneBank數據庫中的擬柱孢藻16S rDNA進行比對,序列相似性達到了99.6%,表明在千燈湖分離到的10株絲狀藻為擬柱孢藻. 數據已上傳至NCBI數據庫,10株藻的登錄號為 MK617302~MK617311.

    在正常的培養(yǎng)條件下,10株擬柱孢藻的藻絲體形態(tài)均為筆直型(圖1),絲體長度范圍在41.0~77.7 μm間,寬度范圍在2.433~3.125 μm間,對10株藻株藻絲體的長寬比值做LSD分析(表2),結果QDH9比值最大,為31.491±12.867,除與QDH2和QDH7無差異外與其他藻株差異顯著(P<0.05),QDH4的比值最低,為16.251±6.287. 除QDH1藻株外,其他9株千燈湖擬柱孢藻均可產生端生異形胞,其形狀如水滴、圓柱或圓錐. 在培養(yǎng)過程中,厚壁孢子也可經常觀察到,其位置主要有亞端生(如QDH3、QDH4、QDH7和QDH9),雙生以及頂端生(QDH5為發(fā)育中的厚壁孢子).

    擬柱孢藻QDH3在培養(yǎng)的第3天在玻璃管底部可見大量黃色沉淀,第6天已經死亡. 其他9株藻在整個培養(yǎng)周期內生長良好(圖2),在實驗結束時,QDH1生物量最高,QDH8最低. 對9株藻第1~7天的比生長速率做LSD分析表明(表2),其中QDH4比生長速率藻株最高,為0.174±0.009 d-1,除與QDH2無差異外與其他藻株均差異極顯著(P<0.001),QDH7的比生長速率最低,為0.075±0.006 d-1,與其他藻株均差異極顯著(P<0.001).

    2.2 擬柱孢藻產毒能力分析

    10株擬柱孢藻均檢測到cyrB和cyrC基因,而ps和pks基因只在QDH7和QDH9藻株中檢出,僅QDH7藻株檢測出6個基因(表3). LC-MS/MS對毒素檢測的結果表明,QDH7藻株的毒素檢測為陽性,其他9株擬柱孢藻均沒有檢到擬柱孢藻毒素,QDH7藻株同時檢到CYN和deoxy-CYN兩種異構體,但異構體CYN濃度極低,deoxy-CYN濃度極高,可達1745.19 ng/mL(表3).

    2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    本研究利用40株(其中10株為本研究分離的藻株)來自不同大陸的擬柱孢藻和2株念珠藻(Nostoc)的雙基因(rpoC1和nifH)序列來構建最大似然進化樹(ML)與最大簡約進化樹(MP). 在 ML 進化樹上 (圖3),來自不同地區(qū)的 40株擬柱孢藻聚類成4個類群:類群I只包含來自墨西哥的藻株,聚成了北美洲分支;類群Ⅱ包括了新西蘭的藻株,聚成了新西蘭分支;來自烏干達和塞內加爾的藻株組成類群Ⅲ聚成了非洲分支;類群Ⅳ由來自中國的藻株和歐洲及澳大利亞藻株的組成,聚集成了澳大利亞/亞洲/歐洲分支,在該分支中中國藻株QDH8、QDH4、CHAB2380和CHAB358與來自德國、法國、澳大利亞的藻株聚集成一個亞類群.

    圖1 千燈湖擬柱孢藻株的形態(tài)特征(放大倍數為10×40,a:厚壁孢子,h:異形胞)Fig.1 Morphological characteristics of Cylindrospermopsis raciborskii strains isolated from Qiandenghu Lake (The magnification is 10×40,a: akinete,h: heterocyst)

    表2 10株擬柱孢藻的形態(tài)特征及比生長速率*

    *藻絲體和異形胞長寬比值的檢驗水平為P<0.05,比生長速率的檢驗水平為P<0.001,表中a、b和c表示顯著性差異.

    圖2 10株千燈湖擬柱孢藻的生長曲線Fig.2 Growth curves of ten strains of Cylindrospermopsis raciborskii from Qiandenghu Lake

    表3 千燈湖10株擬柱孢藻的產毒基因和擬柱孢藻毒素分析*

    *“+”代表陽性;“-”代表陰性.

    圖3 基于41株擬柱孢藻和2株念珠藻的rpoC1和nifH基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(Nostoc sp. PCC6720和Nostoc punctiforme PCC73102為外類群,結點上分別為 ML 和 MP的Bootstrap值)Fig.3 Phylogenetic tree inferred from 41 strains of Cylindrospermopsis raciborskii using two concatenated genes (rpoC1 and nifH), with Nostoc sp. PCC6720 and Nostoc punctiforme PCC73102 as the outgroup, and the nodes were ML and MP Bootstrap values)

    CHAB系列(除了CHAB482)藻株形成一個分支. CHAB482與QDH系列的其他藻株形成了一個亞類群. MP樹的分支情況與ML樹一致,也分為4個大類群,分別為:Ⅰ北美洲、Ⅱ新西蘭、Ⅲ非洲和Ⅳ澳大利亞/亞洲/歐洲,其中類群IV由兩個并系類群組成(圖未展示,Bootstrap值添加于ML樹中).

    3 討論

    本研究發(fā)現在相同的培養(yǎng)條件下,千燈湖10株擬柱孢藻在生長速度、藻絲體長寬、產毒能力、厚壁孢子和異形胞的形成上存在差異,這與前人的研究基本一致[16-17,34-35]. 如Willis 等從澳大利亞Wivenhoe湖采集的單個樣品中分離到24株擬柱孢藻,發(fā)現這些藻株在生長特性、毒素含量和形態(tài)等方面均存在差異[17];隨后Miotto等從Peri Lagoon湖分離出兩株擬柱孢藻,研究顯示它們在溫度、光照、不同營養(yǎng)鹽下的形態(tài)、生長速度和毒素產量等方面存在差異[16];Xiao等研究了藍藻對光照和溫度的耐受,發(fā)現擬柱孢藻的種內差異甚至大于種間差異,表明擬柱孢藻具有高度的可塑性[35]. 另外,Yamamoto和Shiah的研究顯示同一池塘不同季節(jié)分離的擬柱孢藻在比生長速率和厚壁孢子的產生上差異顯著[34];Miotto等同樣發(fā)現Peri Lagoon湖的擬柱孢藻幾乎全年都在浮游植物群落中保持優(yōu)勢地位,可能是因為不同生態(tài)型對環(huán)境的容忍度和偏好導致的[16]. 本研究分離的10株擬柱孢藻中,QDH1藻株即使在缺氮的條件依然不形成異形胞,但PCR擴增可檢測到nifH基因,其序列與NCBI數據庫中其他擬柱孢藻nifH基因的相似性達99.4%,這暗示著該藻株擁有固氮酶基因,但異形胞形成相關的基因存在缺失,已有研究表明異形胞的分化需要大量基因共同參與[36]. 從千燈湖分離的擬柱孢藻很容易產生厚壁孢子,其他學者的研究中也觀察到這種現象[34],一般認為厚壁孢子的產生是擬柱孢藻適應不良環(huán)境的結果,這有利于該藻向溫帶地區(qū)入侵[20].

    目前共發(fā)現了5種擬柱孢藻毒素的同分異構體. 擬柱孢藻毒素(CYN)最為常見[2],其次為deoxy-CYN[37],其他3種異構體則極少報道. 本研究中分離的千燈湖10藻株僅QDH7可產毒并且以deoxy-CYN異構體為主. 這與Jiang等的研究結果類似,他們發(fā)現從我國多個水體分離的擬柱孢藻中產毒藻株比例極低,其中有兩藻株只產生deoxy-CYN[10],因此推測我國的擬柱孢藻產毒的主要類型為deoxy-CYN,其次為CYN.

    擬柱孢藻毒素的合成需要多個基因的分工合作完成,具有完整Cyr基因簇的藻株被認為是區(qū)分具產毒潛能與非產毒潛能藻株最明顯的特征[12,18]. 在本研究中,只有QDH7藻株可完全檢出6個基因,其他9株擬柱孢藻只能檢出2~5個基因,經LC-MS/MS檢測除QDH7外均不產毒,這種產毒基因檢測呈陽性但毒素分析為陰性的現象在前人的研究中比較常見[38-39]. 一些非產毒藻株出現部分產毒基因可能是因為產毒和不產毒藍藻共存下水平基因轉移或插入/刪除所致[36,18,40-41]. Ballot等在多株非產毒束絲藻中檢到cyrA、cyrB和cyrC,認為cyrJ才能較好的指示毒性潛能[38]. 在我們的研究中,非產毒藻株QDH4和QDH9也有cyrJ基因,但是測序對比分析發(fā)現這兩株藻的cyrJ基因均缺失了6個堿基(未發(fā)表的結果),而Jiang等發(fā)現cyrJ存在3種基因類型,可產生CYN的藻株cyrJ基因大多數屬于Jtype2a,而我們的QDH4和QDH9是屬于Jtype2c[10],這種缺失是否影響到cyrJ的表達尚不清楚,因此cyrJ基因的指示作用還有待進一步考證.

    在探討世界范圍內擬柱孢藻的系統(tǒng)進化和起源時,有研究認為多個遺傳標記的共建樹比單個遺傳標記的區(qū)分能力更強大[22,42];例如Haande等發(fā)現pc-IGS、nifH、ITS-L和rpoC1等單個基因建樹不能區(qū)分澳大利亞、非洲和歐洲的藻株,但4個遺傳標記共建樹能夠將非洲、澳大利亞、歐洲和美洲的藻株完全區(qū)分[22],因此本研究選擇兩個遺傳標記基因nifH和rpoC1共建系統(tǒng)發(fā)育樹. 結果表明澳大利亞、亞洲和歐洲藻株具有更高的同源性,這與前人的研究結果基本一致[24,43-45]. 根據Padisák的研究,認為最近擬柱孢藻的入侵是由澳大利亞擴散至亞洲然后再擴散至歐洲,從本文構建的兩株雙基因系統(tǒng)進化樹來看,結果更接近Padisák的假說,推測中國的擬柱孢藻是來自于澳大利亞株系的擴散(圖3). 產毒藻株QDH7和其他幾株非產毒藻株聚集在一起,表明了它們具有高度的同源性,這表明常規(guī)的遺傳標記基因難以區(qū)分產毒和非產毒株系[18].

    4 結論

    同一水體分離的擬柱孢藻株系在生長特性、形態(tài)特征和產毒能力上存在顯著差異,即具有多個生態(tài)型. 從10株擬柱孢藻產毒能力的結果可以看出,千燈湖中的擬柱孢藻以非產毒株占優(yōu)勢,產毒擬柱孢藻以產deoxy-CYN異構體為主. 系統(tǒng)進化分析表明,千燈湖的擬柱孢藻與中國其他地區(qū),澳大利亞以及歐洲的藻株同源性較高,千燈湖產毒株與非產毒株聚集在同一分支,基于nifH和rpoC1等常規(guī)遺傳標記基因構建的系統(tǒng)樹不能區(qū)分產毒株與非產毒株.

    猜你喜歡
    藻株產毒進化樹
    中性脂含量高的微擬球藻藻株的快速篩選?
    基于心理旋轉的小學生物進化樹教學實驗報告
    基于提高乙醇產率的常壓室溫等離子體微藻誘變育種
    常見的進化樹錯誤概念及其辨析*
    生物學通報(2021年9期)2021-07-01 03:24:44
    霉菌毒素什么條件下易產生
    長心卡帕藻兩種顏色藻株的生長差異研究
    小球藻的沼液馴化、抗生素敏感性分析和選擇標記篩選
    孜然精油對產毒黃曲霉的抑制活性研究
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對擴展青霉生長和產毒的影響
    亚洲免费av在线视频| 男人舔奶头视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日本黄色视频三级网站网址| 少妇粗大呻吟视频| 嫩草影视91久久| 男女午夜视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜激情av网站| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线观看www视频免费| 国产在线观看jvid| 99精品欧美一区二区三区四区| 免费av毛片视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 制服丝袜大香蕉在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久性视频一级片| 在线观看午夜福利视频| 91国产中文字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 日本在线视频免费播放| 成人av在线播放网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 啦啦啦免费观看视频1| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久精品欧美日韩精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一进一出抽搐动态| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品免费视频内射| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品av久久久久免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久中文字幕一级| 国产视频内射| 日日夜夜操网爽| 国产精品久久久久久久电影 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产视频一区二区在线看| av天堂在线播放| 搞女人的毛片| 亚洲人与动物交配视频| 日本在线视频免费播放| 亚洲人成电影免费在线| 精品欧美一区二区三区在线| 看片在线看免费视频| 国产午夜精品论理片| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 少妇人妻一区二区三区视频| 91大片在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品爽爽va在线观看网站| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产乱人伦免费视频| 亚洲国产看品久久| 亚洲黑人精品在线| 伦理电影免费视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲中文av在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 91在线观看av| 色噜噜av男人的天堂激情| or卡值多少钱| 国产69精品久久久久777片 | 国产av一区在线观看免费| 免费无遮挡裸体视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| cao死你这个sao货| 两个人看的免费小视频| 91字幕亚洲| 露出奶头的视频| 久久久久性生活片| 亚洲最大成人中文| 国产免费av片在线观看野外av| 中国美女看黄片| 最近最新中文字幕大全电影3| av免费在线观看网站| 在线永久观看黄色视频| 麻豆成人午夜福利视频| 国产午夜精品论理片| 啦啦啦免费观看视频1| 国产成人精品久久二区二区91| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品在线美女| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| av欧美777| 久久精品成人免费网站| 久久 成人 亚洲| 国产精品影院久久| 69av精品久久久久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 舔av片在线| 桃色一区二区三区在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女床上黄色一级片免费看| e午夜精品久久久久久久| 不卡av一区二区三区| 一区福利在线观看| 1024手机看黄色片| 搞女人的毛片| 1024香蕉在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 色老头精品视频在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 一本一本综合久久| 91九色精品人成在线观看| 美女免费视频网站| www.自偷自拍.com| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久国产成人精品二区| 超碰成人久久| 久久天堂一区二区三区四区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3| 香蕉久久夜色| 黄色 视频免费看| 波多野结衣高清无吗| 精品乱码久久久久久99久播| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99热6这里只有精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人一区二区视频在线观看| 一级毛片精品| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一本精品99久久精品77| 久久久久久国产a免费观看| a级毛片a级免费在线| 男女视频在线观看网站免费 | 日韩大尺度精品在线看网址| 18禁观看日本| 视频区欧美日本亚洲| 免费在线观看完整版高清| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲av美国av| 女警被强在线播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线a可以看的网站| 久久中文看片网| 女警被强在线播放| 婷婷精品国产亚洲av| 99久久精品热视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 天天一区二区日本电影三级| 88av欧美| 欧美中文日本在线观看视频| 久久香蕉精品热| 999久久久国产精品视频| 国产99白浆流出| avwww免费| 十八禁人妻一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久香蕉精品热| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 女人被狂操c到高潮| 黄色成人免费大全| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线观看66精品国产| 国产av不卡久久| 久久久国产成人精品二区| 午夜激情av网站| 国产不卡一卡二| 国产成年人精品一区二区| 久久久久久久午夜电影| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜视频精品福利| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品无人区乱码1区二区| 黄片大片在线免费观看| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 久久久久久国产a免费观看| 久久中文看片网| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美黑人精品巨大| 五月伊人婷婷丁香| 日韩精品青青久久久久久| 全区人妻精品视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩免费av在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美乱色亚洲激情| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 成人av一区二区三区在线看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | а√天堂www在线а√下载| 精品久久久久久久久久久久久| 一区二区三区高清视频在线| 欧美成人性av电影在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 日本三级黄在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99re在线观看精品视频| 国产三级在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产av一区二区精品久久| 国产主播在线观看一区二区| 三级毛片av免费| av福利片在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 18禁观看日本| 曰老女人黄片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产亚洲欧美98| 成人三级做爰电影| 色尼玛亚洲综合影院| 国产激情久久老熟女| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲avbb在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 观看免费一级毛片| 国内精品久久久久精免费| 国产探花在线观看一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最近最新免费中文字幕在线| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜福利成人在线免费观看| av天堂在线播放| 免费看十八禁软件| 日韩国内少妇激情av| 黄片小视频在线播放| www国产在线视频色| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久精品吃奶| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品日韩av在线免费观看| 高清在线国产一区| 美女免费视频网站| bbb黄色大片| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩欧美免费精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品91无色码中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲第一电影网av| 五月伊人婷婷丁香| 国产69精品久久久久777片 | 国产精品一区二区三区四区久久| 日本三级黄在线观看| 免费看a级黄色片| 亚洲欧美日韩高清专用| 熟女电影av网| 麻豆av在线久日| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲精品色激情综合| 精品日产1卡2卡| ponron亚洲| 午夜福利在线观看吧| 国产熟女xx| 久久精品影院6| 精品久久久久久久久久久久久| 国产成人系列免费观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品一及| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲 国产 在线| 91国产中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 天天添夜夜摸| 一级毛片高清免费大全| 国产欧美日韩精品亚洲av| 在线播放国产精品三级| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产69精品久久久久777片 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产视频内射| 久久精品人妻少妇| av福利片在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲午夜理论影院| or卡值多少钱| 麻豆一二三区av精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产高清videossex| 成人三级黄色视频| 成年免费大片在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 中亚洲国语对白在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久久久久久久久黄片| 在线播放国产精品三级| 99久久精品热视频| 国产av一区在线观看免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本黄色视频三级网站网址| 久久久久国内视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 手机成人av网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩欧美在线乱码| 舔av片在线| 一级毛片女人18水好多| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲人成网站高清观看| 黄片小视频在线播放| 国产av一区在线观看免费| 午夜a级毛片| 亚洲欧美精品综合久久99| 好男人电影高清在线观看| 日韩av在线大香蕉| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲最大成人中文| 日日干狠狠操夜夜爽| 特级一级黄色大片| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美日韩乱码在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 69av精品久久久久久| 亚洲最大成人中文| 亚洲黑人精品在线| 欧美日韩精品网址| 国产精品 国内视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩大尺度精品在线看网址| 麻豆国产97在线/欧美 | 亚洲18禁久久av| 欧美大码av| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品久久电影中文字幕| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本三级黄在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 伦理电影免费视频| 国产私拍福利视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 可以在线观看毛片的网站| 深夜精品福利| 国产人伦9x9x在线观看| 黄片小视频在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本 av在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 两人在一起打扑克的视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲欧美激情综合另类| 国产在线观看jvid| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产av一区二区精品久久| 伦理电影免费视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 观看免费一级毛片| 变态另类丝袜制服| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| xxx96com| 一a级毛片在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| av中文乱码字幕在线| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线观看午夜福利视频| 亚洲电影在线观看av| 好男人在线观看高清免费视频| 老司机靠b影院| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久99久视频精品免费| 嫩草影视91久久| 在线看三级毛片| 美女免费视频网站| 午夜久久久久精精品| 99热只有精品国产| 国产精品野战在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 香蕉丝袜av| 亚洲国产精品合色在线| www日本黄色视频网| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 啦啦啦免费观看视频1| 国产69精品久久久久777片 | 99re在线观看精品视频| 国产区一区二久久| 午夜福利高清视频| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 大型av网站在线播放| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品综合一区二区三区| netflix在线观看网站| 欧美zozozo另类| 在线a可以看的网站| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中出人妻视频一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国内精品久久久久久久电影| 五月伊人婷婷丁香| 两个人看的免费小视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精华国产精华精| 国产一区二区三区视频了| 免费在线观看成人毛片| 在线观看一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 听说在线观看完整版免费高清| 激情在线观看视频在线高清| 1024手机看黄色片| 精品久久久久久,| √禁漫天堂资源中文www| 深夜精品福利| 国产亚洲精品一区二区www| 久久久久久久精品吃奶| 国产午夜福利久久久久久| 一进一出抽搐动态| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久中文字幕人妻熟女| 小说图片视频综合网站| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲自拍偷在线| 级片在线观看| 亚洲18禁久久av| 看免费av毛片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久草成人影院| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产av不卡久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产99白浆流出| 一级作爱视频免费观看| 日韩免费av在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 我的老师免费观看完整版| 禁无遮挡网站| 在线a可以看的网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| av免费在线观看网站| 久久久久国内视频| 欧美三级亚洲精品| 香蕉国产在线看| 悠悠久久av| 在线观看免费午夜福利视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜老司机福利片| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av| www国产在线视频色| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 久久伊人香网站| 精品国产美女av久久久久小说| 精品第一国产精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产1区2区3区精品| videosex国产| 国产伦一二天堂av在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色成人免费大全| 禁无遮挡网站| ponron亚洲| xxxwww97欧美| 国产成人系列免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品久久久人人做人人爽| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲av成人av| 久久 成人 亚洲| 国产午夜精品久久久久久| 窝窝影院91人妻| 露出奶头的视频| 香蕉久久夜色| 男女之事视频高清在线观看| 色老头精品视频在线观看| 免费看十八禁软件| 动漫黄色视频在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 黄色片一级片一级黄色片| 此物有八面人人有两片| 国产单亲对白刺激| 国产精品av视频在线免费观看| xxx96com| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99国产精品99久久久久| av在线天堂中文字幕| 特级一级黄色大片| 国产精品 国内视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 色综合欧美亚洲国产小说| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 99精品欧美一区二区三区四区| 脱女人内裤的视频| 国产一区二区激情短视频| 香蕉久久夜色| 日韩av在线大香蕉| 亚洲国产高清在线一区二区三| 91国产中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产视频内射| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久伊人香网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 麻豆一二三区av精品| 51午夜福利影视在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久9热在线精品视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人国产一区在线观看| 看免费av毛片| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美日韩精品网址| 午夜精品在线福利| 此物有八面人人有两片| 成熟少妇高潮喷水视频| 两个人免费观看高清视频| 观看免费一级毛片| 色综合站精品国产| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本 欧美在线| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜福利欧美成人| 亚洲天堂国产精品一区在线| 天堂√8在线中文| 成人精品一区二区免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| or卡值多少钱| 亚洲一区中文字幕在线| 国产成人影院久久av| 久久精品人妻少妇| 精品日产1卡2卡| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品高清国产在线一区| 国产高清有码在线观看视频 | 黄色 视频免费看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| videosex国产| 国产亚洲精品一区二区www|