Rho蛋白調(diào)控血小板細(xì)胞骨架重排的分子機(jī)制研究進(jìn)展

楊 穎,田文沁

(北京大學(xué)人民醫(yī)院 輸血科，北京100044)

血小板是血液循環(huán)中體積較小的無核細(xì)胞，由骨髓中的巨核細(xì)胞產(chǎn)生，其在止血和血栓形成的過程中發(fā)揮了重要的作用[1]。當(dāng)血管發(fā)生損傷時(shí)，血小板能夠黏附于受損的血管內(nèi)皮，并形成血栓，進(jìn)而發(fā)揮止血的作用[2]。然而，血小板的過度活化可以導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生[3]。血小板在活化的過程中會(huì)發(fā)生細(xì)胞骨架的重排，進(jìn)而引起其形態(tài)變化、顆粒分泌以及聚集等一系列改變。骨架相關(guān)分子參與調(diào)控血小板細(xì)胞骨架重排，這其中就包括Rho蛋白[4]。本文擬對(duì)Rho蛋白調(diào)控血小板細(xì)胞骨架重排的分子機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Rho蛋白的概述

Rho蛋白是一組相對(duì)分子質(zhì)量為20-25 kD的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合蛋白，因其具有GTP酶活性，又被稱為Rho GTP酶，Rho GTP酶在調(diào)控細(xì)胞骨架重排方面發(fā)揮重要的作用。已知的Rho蛋白家族有20余個(gè)成員，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同，可分為Rho亞家族、Rac亞家族、Cdc42亞家族、Rnd亞家族、Rho BTB亞家族等[5,6]。其中，Cdc42、Rac1和RhoA是目前研究最多的Rho蛋白。Rho蛋白是一種開關(guān)蛋白，包括無活性的GDP結(jié)合的形式以及有活性的GTP結(jié)合的形式，這二者之間在Rho蛋白調(diào)控分子的調(diào)控下可以相互轉(zhuǎn)換[7]?；罨腞ho蛋白即GTP結(jié)合的Rho蛋白可以與下游的效應(yīng)分子結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)等作用[8]。研究表明，Rho蛋白家族的Cdc42、Rac1和RhoA在血小板中均有表達(dá)，它們?cè)谘“迨湛s、偽足形成以及顆粒分泌等發(fā)面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[9-11]。

2 Rho蛋白在血小板中的調(diào)控作用

2.1 RhoA調(diào)控血小板收縮并維持血栓穩(wěn)定性

當(dāng)血小板激活劑如凝血酶、血栓烷類似物等與血小板表面膜受體結(jié)合后，可以使血小板活化。活化的血小板其膜受體可以發(fā)生一系列分子結(jié)構(gòu)的改變，其中Gα13亞基可以激活p115RhoGEF，進(jìn)而使RhoA活化?；罨腞hoA可以激活其下游效應(yīng)分子Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK)，活化的ROCK可以增強(qiáng)肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)肌球蛋白收縮[12]。同時(shí)，活化的RhoA 還可以激活另一個(gè)重要的下游效應(yīng)分子mDia(Mammalian Diaphanous related protein，mDia)，活化的mDia分子可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的延伸和成核，進(jìn)而在血小板內(nèi)形成新的應(yīng)力纖維，促進(jìn)血小板的收縮和遷移運(yùn)動(dòng)[13]。

整合素受體在RhoA對(duì)血小板的調(diào)控過程中也發(fā)揮了重要的作用。血小板活化后，Gα13亞基在激活RhoA的同時(shí)，可以與血小板膜表面的整合素受體αⅡbβ3的胞內(nèi)段β3亞基結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Src激酶的活化，活化的Src激酶可以激活p190RhoGAP，從而使GTP水解，導(dǎo)致RhoA失活。隨后，血小板胞內(nèi)的鈣信號(hào)通路被激活，鈣調(diào)蛋白可以將整合素受體αⅡbβ3的胞內(nèi)段的β3亞基剪切掉，從而抑制Src激酶的活性，使失活的RhoA恢復(fù)活性形式[14]。RhoA的這一變化過程，在促進(jìn)血小板的收縮、促進(jìn)血塊的彈性回縮以及維持血栓穩(wěn)定性的過程中發(fā)揮了重要的作用。研究表明，RhoA缺陷的小鼠，其血小板的收縮能力減弱、血栓形成能力減弱以及鼠尾出血時(shí)間延長(zhǎng)[11,15]。

2.2 Cdc42促進(jìn)血小板絲狀偽足的形成并調(diào)控其顆粒分泌

Cdc42高表達(dá)于血小板中，當(dāng)凝血酶、ADP等激活劑使血小板活化后，Cdc42聚集于血小板細(xì)胞骨架區(qū)域，通過與下游效應(yīng)分子結(jié)合，促進(jìn)血小板表面絲狀偽足的形成并參與調(diào)控血小板的顆粒分泌。絲狀偽足有助于血小板確定細(xì)胞遷移的方向，顆粒分泌可以促進(jìn)血小板聚集[16,17]。在真核細(xì)胞中，活化的Cdc42激活Wiskott Aldrich綜合征蛋白家族(Wiskott Aldrich syndrome protein，WASP)，進(jìn)而激活肌動(dòng)蛋白相關(guān)(actin related protein 2/3，Arp2/3)復(fù)合體，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白單體組裝成肌動(dòng)蛋白絲，進(jìn)而促進(jìn)絲狀偽足的形成[6]。然而，有研究表明，將Cdc42條件性敲除或者在體系中加入Cdc42的抑制劑，細(xì)胞同樣可以形成絲狀偽足。這也提示了，體系中可能存在與Cdc42功能類似的其他Rho蛋白[18,19]。在血小板中Cdc42調(diào)控絲狀偽足形成的機(jī)制也并不是完全清楚，但是研究表明，Cdc42缺陷的血小板，其絲狀偽足的形成能力減弱，血小板顆粒分泌異常，這也證明了Cdc42在調(diào)控血小板功能方面發(fā)揮了重要的最用[16]。

2.3 Rac1促進(jìn)血小板板狀偽足的形成

Rac亞家族包括Rac1、Rac2和Rac3三個(gè)成員，其中Rac1和Rac2表達(dá)于血小板中，Rac1在血小板中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，Rac2在血小板中的作用并不清楚[20]。與Cdc42類似，當(dāng)凝血酶、膠原等激活劑使血小板活化后，Rac1也聚集于血小板細(xì)胞骨架區(qū)域，誘導(dǎo)血小板表面質(zhì)膜突起，形成板狀偽足。板狀偽足可以促進(jìn)血小板與周圍基質(zhì)形成粘附連接，并形成遷移運(yùn)動(dòng)時(shí)的錨定位點(diǎn)。在血小板中，活化的Rac1激動(dòng)其下游效應(yīng)分子WASP家族富含脯氨酸同源蛋白(WASP family verprolin homologous protein，WAVE)，隨后激活A(yù)rp2/3復(fù)合體，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的形成，進(jìn)而在血小板膜表面形成肌動(dòng)蛋白絲豐富的板狀偽足[21]。研究表明，Rac1缺陷的血小板，其板狀偽足的形成能力減弱，血小板聚集能力減弱[10]。

3 Rho蛋白的調(diào)控分子在血小板中的作用

如前所述，Rho蛋白是一種開關(guān)蛋白，活化的Rho蛋白和非活化的Rho蛋白可以在鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchanging factors，GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)和GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)等分子的調(diào)控下相互轉(zhuǎn)換[22]。

3.1 GEFs對(duì)血小板中Rho蛋白的正向調(diào)控作用

GEFs催化Rho蛋白的GDP的釋放，促進(jìn)Rho蛋白與GTP結(jié)合，從而使Rho蛋白活化。現(xiàn)已知有60余種GEFs參與調(diào)控Rho蛋白的活性。不同的GEFs具有相似的功能結(jié)構(gòu)域，它們都包含1個(gè)DH(Dbl homology domain)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PH(pleckstrin homologyv domain)結(jié)構(gòu)域，前者與Rho蛋白結(jié)合并參與催化其構(gòu)象的改變，后者參與GEFs在胞膜上定位功能。然而，僅有很少數(shù)的GEFs參與調(diào)控血小板中的Rho蛋白[23]。如前所述，p115RhoGEF可以被Gα13亞基激活，進(jìn)而活化RhoA，進(jìn)而在血小板內(nèi)形成新的應(yīng)力纖維，促進(jìn)血小板的收縮和遷移運(yùn)動(dòng)。除此之外，Vav蛋白是血小板中Rac特異性的GEFs。Vav蛋白家族包括三個(gè)成員，分別是Vav1、Vav2和Vav3。血小板活化后，Vav1被激活，促進(jìn)Rac與GTP結(jié)合，活化的Rac可以促進(jìn)血小板板狀偽足的形成[24,25]。目前，在血小板中并沒有發(fā)現(xiàn)Cdc42特異性的GEFs。

3.2 GAPs對(duì)血小板中Rho蛋白的負(fù)向調(diào)控作用

GAPs促進(jìn)Rho蛋白GTP的水解，加速其與GDP結(jié)合，將Rho蛋白由活性狀態(tài)變?yōu)闊o活性狀態(tài)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70余種GAPs參與調(diào)控Rho蛋白的活性，然而GAPs在血小板中的調(diào)控機(jī)制并不完全清楚[26]。已知p190RhoGAP可以使血小板中RhoA失活，在血小板的收縮、血塊的彈性回縮的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶激活的血小板中，IQGAP2參與了血小板絲狀偽足的形成，IQGAP2屬于IQGAPs家族，這個(gè)家族的成員雖然有GAPs相關(guān)結(jié)構(gòu)域，但是其對(duì)Rho蛋白發(fā)揮的是正向調(diào)控作用。IQGAP2參與血小板絲狀偽足形成作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討[27]。

3.3 GDIs對(duì)血小板的調(diào)控作用

GDIs可以捕獲GDP結(jié)合的Rho蛋白，阻礙GDP從Rho蛋白上分離，從而抑制Rho蛋白的活性，并且阻礙Rho蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位[28]。目前已發(fā)現(xiàn)四種作用于血小板的GDIs。蛋白組學(xué)研究表明，GDIsα在血小板中高表達(dá)，其作用機(jī)理并不清楚[29]。GDIs在血小板中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，Rho蛋白及其調(diào)控分子在血小板細(xì)胞骨架重排方面發(fā)揮了至關(guān)重要的調(diào)控作用，參與了血小板收縮、血小板偽足形成以及血小板顆粒分泌等重要過程。目前我們對(duì)于Rho蛋白在血小板中的作用機(jī)制并不完全清楚，隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，將會(huì)發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控途徑以及靶分子，并探究各種調(diào)控機(jī)制之間的聯(lián)系和制約。同時(shí)，積極探索Rho蛋白在不同血小板相關(guān)疾病中其調(diào)控方式和調(diào)控途徑的相關(guān)聯(lián)系。相信隨著研究的不斷深入，Rho蛋白能夠成為血小板相關(guān)疾病預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。