間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在炎癥性腸病治療中的作用機(jī)制及應(yīng)用前景

楊少鵬 綜述 張曉嵐 審校

炎癥性腸病（inf lammatory bowel diseases，IBD）是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分明確的非特異性腸道疾病，主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，其發(fā)病率逐年提高[1]。該病病程長，易復(fù)發(fā)，甚至出現(xiàn)各種全身并發(fā)癥及癌變，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量與生存期。目前治療IBD 的藥物如糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等不良反應(yīng)較多，對于重癥患者療效有限[2]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的靶點，抗TNF 藥物英夫利西單抗和阿達(dá)木單抗等生物制劑的問世讓IBD 的治療效果得到了很大的改善，是重癥患者的“拯救性”治療藥物。然而，約有30%的患者對英夫利西單抗原發(fā)性無應(yīng)答[3]，并且近20%～40%患者由于繼發(fā)性失應(yīng)答或嚴(yán)重的不良反應(yīng)而停藥[4-5]，其他新型生物制劑也仍處于起始階段。因此，探索IBD新的治療手段對改善目前的治療困境具有重要意義。

干細(xì)胞移植是IBD 治療領(lǐng)域的研究熱點，其中間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫紊亂及促進(jìn)黏膜修復(fù)等作用，有望成為IBD 的新興治療手段。隨 著研究不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植的MSCs 大多數(shù)停留在肝臟與肺部，只有＜ 1%會最終定植于受損腸道[6-7]，卻仍能有效緩解結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥。這些研究間接說明MSCs 可能通過分泌具有抗炎功能的生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用。MSCs 來源的外泌體（mesenchymal stem cells- derived exosome，MSCs-Exo）是MSCs 通過旁分泌的納米級細(xì) 胞外囊泡，具有MSCs 的大部分功能，無惡性分化且較MSCs免疫原性更低[8]，更好地彌補MSCs移植應(yīng)用中的不足。本文綜述了MSCs-Exo 的概況及其在IBD 治療中的機(jī)制及應(yīng)用前景，以期為深入研究MSCs-Exo 治療IBD 方面提供借鑒。

一、外泌體的形成、成分與功能

外泌體是1981年首次由Trams 等[9]提出的一類直徑約40～160 nm（平均100 nm）的納米級雙層膜結(jié)構(gòu)的外囊泡。外泌體的形成始于細(xì)胞內(nèi)吞與細(xì)胞膜內(nèi)陷，細(xì)胞通過這兩種方式將胞外的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類以及代謝產(chǎn)物連同細(xì)胞表面蛋白一起進(jìn)入細(xì)胞，在高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用下形成早期胞內(nèi)體[10]。早期胞內(nèi)體經(jīng)發(fā)育成熟后成為晚期胞內(nèi)體，晚期胞內(nèi)體膜包裹多個含有特異分選的蛋白、核酸等物質(zhì)的管腔囊泡形成多泡體（multivesicular bodies，MVBs）。隨后，大部分MVBs 與溶酶體或自噬小體融合最終導(dǎo)致 MVBs 的內(nèi)含物降解，而少數(shù)MVBs 通過其膜表面的CD63、溶酶體跨膜蛋白1、溶酶體跨膜蛋白2 等與細(xì)胞質(zhì)膜融合，并向胞外釋放將所含的管腔囊泡形成外泌體[11-13]。

外泌體含有豐富的內(nèi)容物，例如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等。根據(jù)ExoCarta 數(shù)據(jù)庫（http://www.exocarta.org/）最新顯示，已在外泌體中檢測出41 860種蛋白、1 116種 脂質(zhì)、3 408種信使RNA（messenger RNA，mRNA）及2 838種微小RNA（microRNA，miRNA），它們分別在外泌體中扮演十分重要的角色。例如外泌體的胞漿蛋白Rabs 和Annexin 可調(diào)節(jié)膜骨架動態(tài)性且有利于膜融合[14]；而膜蛋白CD9、CD63 及CD81定位于外泌體的表面并用于外泌體的鑒定[15]。脂質(zhì)中的神經(jīng)酰胺與外泌體的形成與釋放密切相關(guān)[16]。外泌體中的另一重要的物質(zhì)miRNA 是眾多研究者們關(guān)注的焦點，當(dāng)母細(xì)胞分泌的外泌體進(jìn)入靶細(xì)胞后，它們攜帶的miRNA 將與靶基因結(jié)合調(diào)控其表達(dá)進(jìn)而影響靶細(xì)胞生理功能。目前人們對外泌體內(nèi)容 物在不同疾病中作用的了解仍十分有限，何種內(nèi)容物為外泌體發(fā)揮功能的 關(guān)鍵分子值得進(jìn)一步探索。

二、MSCs-Exo 在IBD 中的治療作用

（一）MSCs-Exo 具有治療IBD 的潛能

外泌體不但能夠反應(yīng)機(jī)體的生理狀態(tài)，還與其來源的細(xì)胞具有相似的功能。因此，外泌體除了可用于作為疾病的診斷標(biāo)記物外，其治療功能更是備受關(guān)注，尤其是來源于MSCs 的外泌體。MSCs 是一類來 源于中胚層的多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，能夠發(fā)育成骨、脂肪等并可以接受移植[17]，是目前基礎(chǔ)和臨床研究最廣泛的干細(xì)胞種類之一。最初研究者發(fā)現(xiàn)，將MSCs 的條件性培養(yǎng)基注射到實驗性結(jié)腸炎小鼠的腹腔后，可緩解腸道炎癥，減輕疾病活動指數(shù)并且提高模型鼠的存活率，與MSCs 療效無明顯差異[18]。該研究初步說明了MSCs 可能通過旁分泌途徑發(fā)揮抗炎功能。國內(nèi)學(xué)者Yang 等[19]在2015年從骨髓MSCs 中分離出細(xì)胞外囊泡（主要為微囊與外泌體），進(jìn)行動物實驗發(fā)現(xiàn)MSCs 來源的外囊泡可逆轉(zhuǎn)三硝基苯磺酸鈉誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎。因此，該研究在MSCs-Exo 治療IBD 研究領(lǐng)域中打開了新視角。

（二）MSCs-Exo 治療IBD 的機(jī)制

MSCs 應(yīng)用于IBD 治療的研究已經(jīng)取得較大的進(jìn)展，但是MSCs-Exo 在IBD 中的治療作用與機(jī)制的探索仍處于起步階段。MSCs-Exo 治療IBD 的作用機(jī)制可能是多方面的，從現(xiàn)有的研究上看，主要集中在免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)腸道上皮屏障修復(fù)兩大方面。以下將主要從這兩方面介紹MSCs- Exo 治療IBD 的可能機(jī)制。

1.MSCs-Exo 調(diào)節(jié)腸黏膜固有免疫：腸黏膜免疫異常，主要包括固有免疫和適應(yīng)性免疫，是導(dǎo)致 IBD 發(fā)病的關(guān)鍵因素[20]。固有免疫為腸黏膜免疫異常的啟動因素，巨噬細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞參與其中并發(fā)揮重要作用。目前多數(shù)研究主要集中于MSCs-Exo 對巨噬細(xì)胞的調(diào)控方面，尤其是MSCs-Exo 調(diào)控巨噬細(xì)胞向抗炎表型分化在IBD 中的作用及機(jī)制等方面已經(jīng)取得進(jìn)展。體外研究發(fā)現(xiàn)，將脂多糖刺激后的巨噬細(xì)胞與來自骨髓MSCs-Exo 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)24 h后帶有綠色熒光標(biāo)記的MSCs-Exo 能夠被巨噬細(xì)胞攝取，將M1型促炎巨噬細(xì)胞分化為M2型抗炎巨噬細(xì)胞，下調(diào)白介素 -6（interleukin 6，IL-6）、TNF-α 及IL-12 等炎癥因子的表達(dá)[21]。該現(xiàn)象也在動物實驗中得到進(jìn)一步證實[21-22]。值得注意的是，當(dāng)應(yīng)用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo 在實驗性結(jié)腸炎小鼠中的 治療效果降低[23]。因此，巨噬細(xì)胞可能是MSCs-Exo 發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。有學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，脂肪MSCs-Exo 中含有炎癥保護(hù)因子TNF-α 刺激基因-6（TNF-α stimulated gene-6，TSG-6），該抗炎因子可能是調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白[24]。

2.調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫：適應(yīng)性免疫是IBD 發(fā)生并呈慢性持續(xù)狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)，CD4+T細(xì)胞是腸黏膜免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。在抗原刺激下CD4+T細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）。目前MSCs-Exo 對適應(yīng)性免疫調(diào)控的研究尚不多見，主要集中于Th17 及Treg細(xì)胞。Th17細(xì)胞參與IBD 的發(fā)生，Th17細(xì)胞過度增殖與活化與潰瘍性結(jié)腸炎的疾病活動情況有關(guān)[25]。Chen 等[26]發(fā)現(xiàn)來源于骨髓MSCs 的外囊泡（包含外泌體）可能通過抑制Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt及STAT3 的表達(dá)，從而下調(diào)結(jié)腸炎大鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞的比例及IL-17A、IL-21 等炎癥因子的分泌減輕腸道炎癥，其治療效果可能存在劑量依賴。然而該研究所提取的骨髓MSCs 外囊泡直徑為30～1 000 nm，成分相對復(fù)雜，可能存在外泌體以外的物質(zhì)，因此未能直接證明MSCs-Exo 對Th17細(xì)胞的調(diào)控作用。具有免疫耐受調(diào)節(jié)功能的Treg細(xì)胞在維持腸道黏膜免疫的穩(wěn)態(tài)中扮演著重要的角色，IBD患者多存在Treg細(xì)胞數(shù)量或功能異常。An 等[24]分離出犬骨髓的MSCs-Exo 與犬的外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo 可提高Foxp3+T細(xì)胞比例；進(jìn)一步通過動物實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，腹腔注射MSCs-Exo 的實驗性腸炎小鼠腸道炎癥更輕，結(jié)腸黏膜中Foxp3+T細(xì)胞數(shù)提高。該研究從細(xì)胞及動物兩個水平上說明了MSCs-Exo 調(diào)控Treg細(xì)胞的分化可能是其治療IBD 的重要途徑。

3.提高M(jìn)SCs-Exo 免疫調(diào)節(jié)功能的途徑：除此之外，應(yīng)用炎癥因子對MSCs 進(jìn)行預(yù)處理可能提高M(jìn)SCs-Exo 的免疫調(diào)節(jié)功能及抗炎能力。有研究應(yīng)用TNF-α 及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）預(yù)處理MSCs后再提取外泌體，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后的MSCs-Exo 中具有免疫抑制功能的蛋白，如TSG-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β 及前列腺素E2 等，其表達(dá)均高于未處理組；而且經(jīng)TNF-α 及IFN-γ 預(yù)處理后的MSCs-Exo促進(jìn)Treg細(xì)胞及M2型抗炎巨噬細(xì)胞分化的能力有所提高，在實驗性結(jié)腸炎小鼠中的治療效果更好[27]。MSCs 的免疫調(diào)節(jié)能力與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，不同培養(yǎng)條件所獲得的MSCs-Exo 免疫調(diào)節(jié)功能可能存在差異[28]。因此，從改變MSCs 的培養(yǎng)條件為視角，如缺氧、炎癥因子預(yù)處理及3D 培養(yǎng)等，探索提高M(jìn)SCs-Exo 治療效果的方案值得進(jìn)一步研究[29-30]。

4.MSCs-Exo 促進(jìn)腸上皮屏障修復(fù)：腸上皮屏障由腸上皮細(xì)胞緊密連接組成，在抵御病原體入侵及維持腸黏膜正常功能中發(fā)揮重要作用，而腸上皮屏障損傷是IBD 的重要病理改變[31]。骨髓MSCs 分泌的外囊泡通過下調(diào)實驗性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸中caspase3、caspase8 及caspase9 的表達(dá)，從而抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡修復(fù)受損腸道，并且這種抑制效應(yīng)與所注射的外囊泡劑量有關(guān)[19]。另一研究將MSCs-Exo 注射到壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠模型中，4 h后檢測大鼠血清發(fā)現(xiàn)注射MSCs-Exo 大鼠血清中FITC-D 濃度低于PBS 注射組，證明了MSCs-Exo 能夠降低腸黏膜的通透性，進(jìn)而維持腸上皮屏障的完整，促進(jìn)受損腸道修復(fù)[32]。McCulloh 等[33]通過應(yīng) 用不同細(xì)胞來源的MSCs-Exo 對同樣的疾病模型進(jìn)行干預(yù)后也證實了這一現(xiàn)象。以上的研究均未對MSCs-Exo 修復(fù)腸上皮屏障的機(jī)制做進(jìn)一步探討。

5.MSCs-Exo 通過miRNA 發(fā)揮治療作用：除了上述介紹的作用機(jī)制外，MSCs-Exo 還可能通過miR-146a 與炎癥基因TRAF6 和IRAK1 靶向結(jié)合抑制基因的表達(dá)，從而減輕腸道炎癥[34]。其次，MSCs-Exo 還能通過miR-200b 抑制腸上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑，減少實驗性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的發(fā)生[35]。以上結(jié)果表明，MSCs-Exo所攜帶的miRNA 可能是其發(fā)揮治療作用的另一重要內(nèi)容物。此外，抑制泛素蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低NF-κB 和mTOR 的活化也是MSCs-Exo 改善腸道炎癥的機(jī)制之一[36]。

三、MSCs-Exo 在IBD 中的應(yīng)用前景

與MSCs 相比，其分泌的MSCs- Exo 具有更低的免疫源性，而且無細(xì)胞增殖特性，能在體內(nèi)穩(wěn)定存在等優(yōu)勢[36]，可用于彌補MSCs 移植的不足甚至可能替代MSCs 成為IBD 的新興治療方法。在美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）注冊的臨床試驗（ClinicalTrials.gov）顯示，MSCs- Exo 在臨床試驗中的研究主要治療的疾病為Ⅰ型糖尿病、腦血管疾病及黃斑裂孔等，還未涉及到IBD[11]。目前MSCs-Exo 在IBD 中的研究尚不多見，其中大部分為臨床前基礎(chǔ)研究。實驗用于提取MSCs-Exo 的MSCs 主要來源于臍帶、骨髓或者脂肪，并且已經(jīng)在細(xì)胞及動物水平上開展研究，以驗證MSCs-Exo 在IBD 治療中的有效性。在細(xì)胞實驗中，Rager 等[32]通過腸上皮細(xì)胞劃痕試驗發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs-Exo 提高腸上皮細(xì)胞劃痕的愈合率，改善腸上皮屏障功能；此外，MSCs-Exo 被巨噬細(xì)胞攝取后可抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，下調(diào)炎癥因子水平發(fā)揮抗炎作用[21,24]。在動物實驗方面，研究所采用的動物模型大部分為三硝基苯磺酸和葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎大鼠或小鼠模型。這些研究重點觀察了MSCs- Exo 的治療作用，證實了MSCs-Exo 能夠減輕結(jié)腸炎動物模型便血、體重下降等癥狀并改善組織病理評分，提高了動物的存活率[21,36,38]，其機(jī)制可能與MSCs-Exo 具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫及促進(jìn)腸道修復(fù)等作用有關(guān)。這些 研究為未來MSCs-Exo 在IBD 臨床治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因此，MSCs-Exo 在IBD 的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

四、MSCs-Exo 在IBD 治療中的局限性

雖然大多數(shù)基礎(chǔ)實驗表明MSCs-Exo 是潛在治療IBD 的“新武器”，但MSCs-Exo 應(yīng)用于IBD 的臨床治療仍存在許多問題亟待解決。首先，MSCs-Exo 除了含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及miRNA 等內(nèi)容物外，可能還含有其他物質(zhì)，如lncRNA、piRNA及circRNA 等非編碼RNA[39]。目前人們對于這些RNA 的功能了解不多，它們在IBD 中發(fā)揮什么作用、何種非編碼RNA發(fā)揮主要作用仍有待確定。其次， 動物實驗表明MSCs-Exo 的治療效果存在劑量依賴[26,33]，而且MSCs-Exo 應(yīng)用于臨床試驗前更需要確定安全有效的劑量范圍。因此，MSCs-Exo 應(yīng)用于臨床試驗前需要確定標(biāo)準(zhǔn)化定量的方法。目前用于確定MSCs-Exo 劑量主要根據(jù)提取外泌體母細(xì)胞的數(shù)量、外泌體的蛋白濃度或者外泌體的粒子數(shù)等，哪種量化方法更適用于臨床，仍存在許多爭議[40]。最后，不同的分離方法所獲得的MSCs-Exo 純度及數(shù)量可能存在差異，而且不同的給藥途徑可能影響IBD 的治療效果[41]。因此，MSCs-Exo 需要不斷優(yōu)化提取方法，選擇合適的給藥途徑以提高臨床療效。

五、總結(jié)與展望

MSCs-Exo 免疫源性低、易保存且運輸方便，同時具有MSCs 大部分功能，有望成為一種新興的“無細(xì)胞”治療方法。如前文所述，目前MSCs-Exo 在治療IBD 中的研究尚處于起步階段，仍存在許多問題未解決。在探索MSCs-Exo內(nèi)容物的功能方面，研究多集中于探討MSCs-Exo 通過遞送miRNA 發(fā)揮治療作用。然而MSCs-Exo 除了含有miRNA 外，還有大量具有功能的非編碼RNA。以MSCs-Exo 為載體，利用第三代基因組測序的技術(shù)，尋找其 中具有關(guān)鍵作用的非編碼RNA 并探討它們對靶細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控的潛能，對闡明MSCs-Exo 治療IBD 的作用機(jī)制具有重要意義。另一方面，結(jié)合IBD 以消化道受累為主的疾病特征，對比不同給藥途徑及不同劑量在治療效果中的差異，可能為優(yōu)化IBD 的治療方案提供實驗依據(jù)。

綜上所述，由于獨特的生物學(xué)特性及功能，MSCs-Exo 可能成為IBD 潛在的治療藥物。圍繞著MSCs-Exo 內(nèi)容物的功能、提取與定量標(biāo)準(zhǔn)及給藥途徑等方面展開研究，將加快MSCs-Exo 應(yīng)用于臨床治療IBD 的步伐。