肺泡灌洗液在肺癌早期診斷方面的研究進展

楊敬平 楊俊俊 周 嬋 劉 娜 徐興祥

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因。每年約有180萬人被診斷出患有肺癌，其中約有160 萬人死于肺癌［1］。然而在我國約75%的肺癌患者在確診時已屬晚期，5 年生存率僅為15.6%［2］，有研究表明對于Ⅰ期非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者早期手術(shù)切除，其5 年生存率可提高至70%～90%［3］。這表明早期診斷和早期治療在提高肺癌患者生存率、降低死亡率中起著至關(guān)重要的作用。目前世界范圍公認的早期肺癌篩查手段為低劑量CT（low-dose computed tomographic，LDCT），美國國家肺癌篩查試驗（National Lung Screening Trial，NLST）的隨機對照研究結(jié)果顯示LDCT 篩查可使得肺癌死亡率相對降低20.0%，但其假陽性率高達96%［4］，而對于其分辨率無法識別的早期肺癌又易漏診，因此對于肺癌的篩查迫切需要一種創(chuàng)傷小、敏感性高、特異性好的標志物。肺癌是起源于支氣管黏膜上皮及肺泡上皮的惡性腫瘤，脫落的腫瘤細胞及其代謝產(chǎn)物可直接進入肺泡腔內(nèi)，所以支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）較其他液體標本更好的顯示其中組分特異性，肺泡灌洗液中細胞學、分子生物學都可用于肺癌的早期診斷，本文就BALF 中DNA 甲基化、外泌體、端粒酶、非整倍體等在肺癌早期診斷方面的研究作一綜述。

一、DNA 甲基化

DNA 甲基化是表觀遺傳學的一個重要研究領(lǐng)域，DNA甲基化參與了個體發(fā)育和細胞分化等基本生物學過程。在人類多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有DNA 甲基化異常，包括基因啟動子區(qū)域的高甲基化和全基因組低甲基化［5］。有研究表明抑癌基因啟動子區(qū)域高甲基化導致抑癌基因失活，是肺癌發(fā)生的早期事件［6］。有研究表明RASSF1A、APC、ESR1、ABCB1、MT1G 和HOXC9 的啟動子甲基化與早期肺癌有關(guān)［7］，隨著人們對液體活檢的關(guān)注及甲基化特異性PCR 為代表的甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展，研究者相繼發(fā)現(xiàn)了BALF 在肺癌早診斷篩查中的價值。 一項研究發(fā)現(xiàn)SHOX2 和RASSF1A 的甲基化對肺癌的診斷效率比細胞學檢查、血清生物標志物癌胚抗原要高［8］，SHOX2 和RASSF1A 甲基化聯(lián)合對肺癌的診斷靈敏度為81.0%，特異性為97.4%，并發(fā)現(xiàn)SHOX2 和RASSF1A 甲基化在Ⅰ期肺癌患者中檢出率最高，為85.7%，高于晚期肺癌患者。一項Meta 分析顯示BALF 中P16 基因啟動子甲基化在NSCLC 診斷方面具有較好的特異性及的敏感性［9］，分別為0.61，特異性為0.81，有望成為NSCLC 微創(chuàng)診斷方法。Lei Tuo 等［10］的Meta 分析顯示BALF中P16 INK4a 基因啟動子甲基化檢測可能是NSCLC 診斷的潛在生物標志物，但敏感性較低，不適合NSCLC 篩查。現(xiàn)有研究表明肺泡灌洗液中SHOX2 和RASSF1A 的甲基化聯(lián)合診斷對肺癌的早期診斷具有較好特異性及靈敏度，P16 基因啟動子也對肺癌具有較好的診斷價值，但在上訴三者聯(lián)合診斷的價值方面尚缺乏相關(guān)研究及文獻支持。

二、外泌體

外泌體是源于細胞“內(nèi)吞-融合-外排”等調(diào)控過程而形成的胞外納米級多泡體（multivesicular bodies，MVBs），其含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等多種活性成分［11］。外泌體可以由許多類型細胞釋放，如網(wǎng)織紅細胞，樹突細胞，淋巴細胞和癌細胞［12］。外泌體可從許多體液中凈化，如血液，尿液，胸腔積液，腹水和支氣管肺泡灌洗液［13］。腫瘤中外泌體含量比正常細胞多，高達正常細胞的3 倍［14］，且外泌體被高度穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜保護而不被降解［15］。因此，所有這些特征都使外泌體具有成為早期肺癌診斷的潛在標志物的優(yōu)勢。有研究表明，從NSCLC 患者的循環(huán)中外泌體分離出miRNA 與NSCLC 組織中miRNA 表達的模式具有一致性［16］，提示外泌體miRNA 可作為非小細胞肺癌的液體活檢材料。一些研究人員開發(fā)了腫瘤相關(guān)外泌體和非腫瘤外泌體表面組成差異的方法檢測，從而利于腫瘤外泌體的檢出，增加了外泌體檢測的特異性［17］。Jin 等［18］使用let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p 和miR-486-5p 四標記板檢測NSCLS 患者血液外泌體，得出他們對Ⅰ期NSCLC 的鑒別診斷表現(xiàn)出了良好的診斷前景，AUC 為0.899，敏感性為80.25%，特異性為92.31%。目前有研究表明血標本中外泌體在肺癌早期診斷方面存在一定意義。因為肺癌起源于支氣管和肺泡，因此氣道中的標志物比外周血的變化更早、更高［19］。但目前對BALF 中外泌體的研究較少，可能與BALF 中外泌體的收集、分離過程、檢測方法等有關(guān)，由于標本的收集、處理和儲存過程影響外泌體的濃度、組成和功能，從而對接下來的分析產(chǎn)生重大影響［20］。隨著外泌體相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，將來BALF 中外泌體對肺癌早期診斷的價值有望被發(fā)現(xiàn)。

三、端粒酶

端粒酶是延長染色體末端重復DNA 序列長度的逆轉(zhuǎn)錄酶［21］。在大多數(shù)正常細胞中，端粒酶的表達受到嚴格抑制，導致端粒隨著細胞的每一次分裂而逐漸縮短。相比之下，端粒酶活性在90%以上的人類癌細胞中顯著上調(diào)或激活［22］，如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和尿路上皮癌等，提示端粒酶在使細胞成為永生細胞中發(fā)揮著重要作用［23］。正常細胞和癌細胞端粒酶活性的差異使端粒酶成為一種潛在的癌癥診斷生物標志物。有研究證實肺癌與端粒酶活性存在相關(guān)性［22］。Dikmen 等［24］通過檢測肺癌患者BALF 中端粒酶活性，得到其敏感性和特異性分別為72.7%和85.7%，細胞學檢查結(jié)合端粒酶活性的敏感性（81.8%）明顯高于單純細胞學檢查（54.5%），得出細胞學檢查聯(lián)合端粒酶檢測可提高其對肺癌診斷的準確性。有研究表明BALF 中端粒酶活性測定有利于肺外周孤立性結(jié)節(jié)的定性診斷［25］，敏感性為68.5%，特異性為93.2%。目前單分子生物物理學工具包已經(jīng)足夠成熟，許多研究人員已經(jīng)開始開發(fā)直接探測端粒和端粒酶的動態(tài)和異質(zhì)性的分析方法，使得早期監(jiān)測異常端粒酶活性成為可能［26］。因此端粒酶活性的檢測將更好的輔助肺癌的早期診斷。

四、非整倍體

非整倍體是指個別染色體減少或增加一條或幾條而導致染色體數(shù)目非整倍數(shù)，是細胞分裂時染色體分離異常、丟失、易位等的結(jié)果［27］。非整倍體可見于90%的實體瘤和50%的血液腫瘤［28］。染色體不穩(wěn)定性是癌癥發(fā)生的一個主要特征，其通常導致非整倍體的形成［29］，因此非整倍體與早期癌癥存在相關(guān)性，可用于早期診斷。有研究表明細胞DNA定量分析方法檢測非整倍體與液基細胞學（liquid based cytology，LBC）聯(lián)合檢查能提高肺癌的陽性檢出率［30］。一項研究表明在細胞學陰性細胞中，間期核熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）能發(fā)現(xiàn)標志著惡性腫瘤存在的異倍體［31］，所以可能有助于診斷癌前病變及肺癌早期診斷。臨床樣品中非整倍性的檢測對于癌癥中的各種診斷應(yīng)用很關(guān)鍵，通過擴增長散在核苷酸元件（LINEs）方法可應(yīng)用于僅含有少量納克DNA 和少至1%的腫瘤含量的樣品［32］。有研究表明如果非整倍體伴隨有P53 突變、紡錘體組裝檢查位點（spindle assembly checkpoint，SAC）則證明是腫瘤非整倍體［27］，所以隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，將上述指標聯(lián)合檢測將為肺癌早期篩查提供更準確的診斷。

隨著LDCT 在肺癌篩查中的應(yīng)用及影像技術(shù)、影像基因組學的發(fā)展，大多數(shù)肺部疾病患者被檢出肺結(jié)節(jié)，提高了早期肺癌確診率，但仍有部分早期肺癌無法確診，所以需要分子生物學、細胞學等的補充，從而有助于預測肺結(jié)節(jié)性質(zhì)、優(yōu)化治療效果、防止過度診療或治療不足。研究表明支氣管肺泡灌洗液作為肺癌早期篩查和診斷有很好的前景，但還有許多問題需要克服：①BALF 中分子標志物作為肺癌的新興標志物，其在肺癌發(fā)生發(fā)展演化過程中的具體機制尚未完全清楚，單個指標的敏感性及特異性不高，這就需要我們尋找最佳的分子組合或聯(lián)合其他診斷方法，從而為肺癌的早期診斷提供全面有效的手段；②由于BALF 中各種指標的檢測方式不一樣，所以需要收集BALF 的量、保存條件、分離方法等有所不同，目前受標志物檢測技術(shù)的限制和高成本，也成為其廣泛應(yīng)用的一個障礙；③分子標志物的研究尚缺乏大樣本實驗驗證其有效性。總之，BALF 中分子標志物具有肺癌早期篩查的潛質(zhì)，上述問題將是我們未來研究的重點及需要攻克的難關(guān)。