響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備全豆豆?jié){工藝

黃磊，候吉超，樸春紅，代偉長，王玉華，劉俊梅，于寒松

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系加工研究室，吉林長春130118）

古往今來，豆制品是人類攝取大豆?fàn)I養(yǎng)成分的最佳方式，而豆?jié){又是工藝相對簡單和最受歡迎的豆制品之一。傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝在使用1 kg 大豆原料制備豆?jié){時，添加約8 kg～10 kg 水過濾后產(chǎn)生大約0.3 kg 的豆渣（干基）[1]。豆渣由于水分活度高，容易造成腐敗，在商業(yè)生產(chǎn)和工廠管理問題上沒辦法得到更好的解決。豆渣通常被浪費(fèi)掉或者用來制作動物飼料[2]。但是，豆渣中含有很豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)（25.4%～28.4%），油（9.3%～10.9%），膳食纖維（52.8%～58.1%）和異黃酮（0.14%）[3]含量都比較高，如果丟棄對于大豆資源利用率來說是非常嚴(yán)重的浪費(fèi)。而且，在浪費(fèi)了原材料和增加了成本的同時，還對環(huán)境造成了污染。

而全豆豆?jié){不僅可以保留大豆原料的全部營養(yǎng)成分，不造成任何浪費(fèi)，與傳統(tǒng)豆?jié){相比還大大提高了豆?jié){中膳食纖維的含量[4]，同時，可以解決上述豆渣的浪費(fèi)和造成的環(huán)境壓力的問題，同時節(jié)省了大量處理豆渣需要的人力物力和財力。既保證了營養(yǎng)，又降低了成本，提高了產(chǎn)品附加值，還可以做到綠色環(huán)保。

目前，全豆（全籽粒）產(chǎn)品的開發(fā)逐漸成為國內(nèi)外大豆加工領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5]。但關(guān)于全豆豆?jié){工藝的優(yōu)化的報道較少，大部分都是研究全豆豆?jié){及全豆豆腐的質(zhì)構(gòu)特性及對豆腐產(chǎn)品的感官特性進(jìn)行評價[6-8]。制備全豆?jié){的方法有很多種，例如濕式超細(xì)粉碎法，干式超細(xì)粉碎法和酶水解法。已有學(xué)者使用干法、濕法超微粉碎結(jié)合高壓均質(zhì)可以使全籽粒大豆制作成為全豆豆?jié){[9-10]。然而，由于單次使用干式微研磨或濕式超細(xì)粉碎，整個豆?jié){的感官品質(zhì)未得到優(yōu)化。根據(jù)吳金鋆等[11]研究表明，干法磨粉制作方法體系穩(wěn)定較差，而且產(chǎn)品顆粒感較強(qiáng)，感官上讓消費(fèi)者難以接受，同時，根據(jù)Owsley 等[12]研究表明，原料顆粒度的減小可以增大原料與消化酶的接觸面積，從而增加原料與消化酶的相互作用頻率。也就說明全豆豆?jié){粒徑的減小有利于其在體內(nèi)的消化吸收。因此，如何降低全豆豆?jié){的顆粒直徑成為了全豆豆?jié){工藝的關(guān)鍵技術(shù)問題，也是其產(chǎn)業(yè)化所必須突破和解決的關(guān)鍵問題。據(jù)報道，目前全豆豆?jié){粒徑最小的是采用濕法超微粉碎結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)獲得的產(chǎn)品，該產(chǎn)品的D50為37.07 μm[13]。本研究擬聯(lián)合使用濕法微粉碎和酶水解的方法進(jìn)一步降低全豆豆?jié){粒徑，其中濕法微研磨可以將大豆與水充分研磨和混合，酶解法可以對大顆粒的不可溶性膳食纖維起到了一定的裂解作用，不僅可以降低豆?jié){的粒徑，同時還可以改善了豆?jié){的口感并增加豆?jié){中可溶性物質(zhì)的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

黑河43 號大豆：國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家鹿文成研究員提供；纖維素酶（酶活力60 000 U/g）：江萊生物科技有限公司；蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)儀器

YY-162 大豆脫皮機(jī)：山東譽(yù)亞大豆機(jī)械有限公司；QDGX-1 高精密濕法超微粉碎設(shè)備：無錫輕大食品裝備有限公司；BT-9300HT 激光粒度分布儀：丹東百特儀器有限公司；THZ-82 恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

挑選顆粒圓潤，無雜質(zhì)，無蟲蛀的黑河43 號大豆，使用大豆脫皮機(jī)脫去表層果皮。取1 kg 脫皮黑河43號大豆，進(jìn)行清洗后，加入5 倍蒸餾水浸泡12 h～14 h，去除多余水分后，110 ℃壓熱15 min。

1.3.2 全豆豆?jié){的制備

將壓熱后的大豆與11 倍蒸餾水混合在3 000 r/min下超微粉碎15 min 后，將獲得的全豆豆?jié){稱重，加入纖維素酶，使用恒溫振蕩器在100 r/min 下進(jìn)行酶解處理。分別對酶解溫度、酶解時間和加酶量進(jìn)行單因素和響應(yīng)曲面試驗(yàn)。

1.3.3 酶解溫度對全豆豆?jié){粒徑（D50）的影響

取底物干物質(zhì)含量3%的纖維素酶，分別在40、45、50、55、60 ℃下酶解 3 h。對全豆豆?jié){的粒徑進(jìn)行測定比較分析。

1.3.4 酶解時間對全豆豆?jié){粒徑（D50）的影響

取底物干物質(zhì)含量3%的纖維素酶，在50 ℃下分別酶解 1、2、3、4、5 h。對全豆豆?jié){的粒徑進(jìn)行測定比較分析。

1.3.5 加酶量對全豆豆?jié){粒徑（D50）的影響

分別取相當(dāng)于底物干物質(zhì)含量1%、2%、3%、4%和5%的纖維素酶，在50 ℃下分別酶解3 h。對全豆豆?jié){的粒徑進(jìn)行測定比較分析。

1.3.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

將單因素的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，設(shè)置合適范圍進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)。選擇Box-Behnken 組合試驗(yàn)，選取中位徑（D50）作為最終評判標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計三因素三水平響應(yīng)曲面試驗(yàn)，以確定最佳酶解法制備全豆豆?jié){的工藝。響應(yīng)曲面試驗(yàn)的因素與水平情況見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。在單因素方差分析（ANOVA）之后，進(jìn)行事后檢驗(yàn)以使用IBM SPSS統(tǒng)計數(shù)據(jù)（版本19.0）檢測組間平均值之間的差異。顯著性定義為P 值小于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對全豆豆?jié){粒徑的影響

酶解溫度對全豆豆?jié){粒徑的影響見圖1。

由圖1 可知，隨著酶解溫度不斷升高，全豆豆?jié){的粒徑（D50）不斷降低，這是由于酶解溫度在逐漸接近纖維素酶的最適溫度，在50 ℃的時候粒徑（D50）最小，其表明纖維素酶達(dá)到了最適酶解溫度，此刻酶解效果最佳。50 ℃后又略有升高。這也證實(shí)了纖維素酶具有較高酶活性的溫度范圍為45 ℃～55 ℃，此次試驗(yàn)最佳酶解溫度為50 ℃。

圖1 酶解溫度對全豆豆?jié){粒徑的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the particle size of whole soybean milk

2.2 酶解時間對全豆豆?jié){粒徑的影響

酶解時間對全豆豆?jié){粒徑的影響見圖2。

圖2 酶解時間對全豆豆?jié){粒徑的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the particle size of whole soybean milk

從圖2 可以看出，隨著酶解時間的逐漸增加，全豆豆?jié){的粒徑（D50）不斷降低，但是在酶解 3 h～5 h 時，粒徑（D50）變化不顯著。其表示3 h 已經(jīng)是酶解的最佳時間，再延長時間從其作用也不會十分明顯，從節(jié)省能源和經(jīng)費(fèi)的角度考慮，選擇最佳酶解時間為3 h。

2.3 加酶量對全豆豆?jié){粒徑和可溶性膳食纖維的影響

加酶量對全豆豆?jié){粒徑的影響見圖3。

圖3 加酶量對全豆豆?jié){粒徑的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the particle size of whole soybean milk

根據(jù)圖3 可知，隨著加酶量的逐漸增加，全豆豆?jié){的粒徑（D50）不斷降低，在加酶量為3%的時候，其粒徑值（D50）最低。在加酶量為 3%～5%的時候，粒徑（D50）變化不顯著（P＞0.05）。從節(jié)省試驗(yàn)材料和經(jīng)費(fèi)考慮，選擇最佳加酶量為底物干物質(zhì)量的3%。

2.4 響應(yīng)曲面結(jié)果分析

通過以上試驗(yàn)所得出的數(shù)據(jù)和結(jié)論進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計。通過軟件分析，方差分析表（表2、表3）可知，二次模型失擬檢驗(yàn)其結(jié)果為不顯著，標(biāo)示著二次模型可以用于該試驗(yàn)的優(yōu)化，最后結(jié)果選取二次方程作為模型。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計表和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental design and results of response surface methodology（RSM）

表3 試驗(yàn)結(jié)果（粒徑D50）方差分析表Table 3 Test results（particle diameterD50）analysis of variance table

續(xù)表3 試驗(yàn)結(jié)果（粒徑D50）方差分析表Continue table 3 Test results（particle diameterD50）analysis of variance table

得到方程：粒徑D50=+16.85-12.26A-2.98B-2.22C+4.20AB+2.40AC+3.68BC+9.96A2+5.64B2+14.86C2

在方差分析結(jié)果顯示，模型的P 值＜0.000 1，表示模型的差異顯著。僅有0.01%的可能性該模型不可使用，所以，可以使用此模型。在本次試驗(yàn)中，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2，均是顯著項(xiàng)（P≤0.01）。失擬檢驗(yàn)中的P 值為0.058 表明失擬項(xiàng)與標(biāo)準(zhǔn)誤相比不顯著，只有5.80%可能性失擬發(fā)生躁動，擬合情況良好。按照F 值的影響大小對結(jié)果影響排序?yàn)椋杭用噶浚久附鈺r間＞酶解溫度。

從Design-expert 軟件中獲得了響應(yīng)曲面圖見圖4～圖6。

圖4 加酶量和酶解時間的交互作用（粒徑D50）Fig.4 Interaction of Enzyme Addition and Enzymatic Time（Particle Size D50）

圖5 加酶量和酶解溫度的交互作用（粒徑D50）Fig.5 Interaction of Enzyme Addition and Enzymatic Temperature（Particle Size D50）

圖6 酶解時間和酶解溫度的交互作用（粒徑D50）Fig.6 Interaction between enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature（Particle Size D50）

從圖4～圖6 可以直觀的看到兩因素的交互作用對酶解（粒徑D50）試驗(yàn)結(jié)果的影響，曲面表現(xiàn)出逐漸下降趨勢并達(dá)到一定的頂點(diǎn)隨后又有上升的趨勢，曲面坡度的陡峭程度表明結(jié)果的變化幅度，表明出現(xiàn)了最小值，通過使用軟件的數(shù)據(jù)分析可以得出最佳的工藝條件。

2.5 粒徑響應(yīng)曲面優(yōu)化的最佳工藝和試驗(yàn)驗(yàn)證

通過Design-expert 軟件對試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：加酶量為2.45%，酶解時間為3.45 h，酶解溫度為50.32 ℃。為了便于試驗(yàn)操作，將得到的最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果做稍微的調(diào)整，加酶量為2.50%，酶解時間為3.50 h，酶解溫度為50.00 ℃。得到最小中位徑 D50為（16.09±0.12）μm 的全豆豆?jié){。對以上數(shù)據(jù)作為試驗(yàn)條件反復(fù)進(jìn)行3 次試驗(yàn)，得到的最終結(jié)果與最佳工藝條件結(jié)果的吻合度較高，具有較強(qiáng)的可信度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對全豆豆?jié){進(jìn)行纖維素酶的酶解處理，最終酶解后的試驗(yàn)表明：通過單因素試驗(yàn)獲得最佳酶解溫度為50.00 ℃，酶解時間為3.00 h，加酶量為3.00%，在經(jīng)過單因素的試驗(yàn)后，使用Design-expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，驗(yàn)證后為了方便試驗(yàn)操作，試驗(yàn)結(jié)果均取操作最方便的數(shù)值。酶解溫度選取50.00 ℃，酶解時間選取3.50 h，加酶量為2.50%（底物干物質(zhì)）。獲得全豆豆?jié){D50為16.09 μm。與未加酶的全豆豆?jié){（D5063.54 μm） 比較，D50縮小了 3.95 倍，D90縮小了2.02 倍。對優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表示預(yù)測性相對較好，可以用來預(yù)測該工藝試驗(yàn)。酶解試驗(yàn)的結(jié)果與所見論文的論述結(jié)論基本吻合。該試驗(yàn)結(jié)果可以為全豆豆?jié){加工生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考，對豆制品生產(chǎn)具有一定的實(shí)際意義。