姜黃揮發(fā)油誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及機(jī)理研究

趙明明，盧彩會(huì)，牟德華，*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000）

姜黃揮發(fā)油（Curcuma longa L.volatile oil，TVO）為姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的塊狀根莖經(jīng)水蒸氣蒸餾法得到的揮發(fā)性油，所含成分較為復(fù)雜，一般含有數(shù)十至數(shù)百種組分，其主要成分是芳姜黃酮（約為40%）、姜烯等化合物[1-4]。姜黃揮發(fā)油具有抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗淤血、抗血管生成及降血脂等功能[5-11]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，姜黃揮發(fā)油具有良好的抗腫瘤效果，可以有效抑制人皮膚癌SCL-1[12]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431[13]、肝癌細(xì)胞MMC-7721[14]、急性單核細(xì)胞白血病THP-1 細(xì)胞[15]的增殖。

癌癥是全世界最致命的疾病之一，是人類(lèi)死亡的第二大主因。中國(guó)肺癌發(fā)病率在過(guò)去40 年快速升高，其5 年生存率僅為20%，并已成為中國(guó)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一[16]。肺腫瘤分為兩種組織學(xué)類(lèi)型：15 %為小細(xì)胞型肺癌（small cell lung cancer，SCLC），85%的肺癌病例為非小細(xì)胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），是最常見(jiàn)的侵襲性類(lèi)型細(xì)胞，到NSCLC 被診斷時(shí)，大多數(shù)情況下已經(jīng)擴(kuò)散到身體的其他器官，A549 細(xì)胞便是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的一種[17-18]。由于使用抗癌化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)對(duì)正常體細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒副作用。因此對(duì)于天然產(chǎn)物中高效、低毒的抗癌活性成分研究成為現(xiàn)代國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[19]。最近，植物來(lái)源的生物活性化合物被認(rèn)為是一種有效的抗癌劑，其中植物來(lái)源的精油已被用于醫(yī)藥應(yīng)用[20]。

姜黃中的主要有效活性物質(zhì)是姜黃素類(lèi)化合物和姜黃油，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其功能性的研究報(bào)道主要針對(duì)于姜黃素類(lèi)化合物，由于姜黃揮發(fā)油的提取及溶解的復(fù)雜性故對(duì)于姜黃揮發(fā)油的功能性研究較少。因此，本文從細(xì)胞的活力、形態(tài)、遷移能力、凋亡周期等多方面系統(tǒng)地研究姜黃揮發(fā)油及主要成分抑制A549 細(xì)胞增殖作用及促進(jìn)其細(xì)胞凋亡的機(jī)理。為不斷地深入研究姜黃揮發(fā)油的抗腫瘤作用機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為后期尋找高效且低毒的天然抗癌藥物開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549 細(xì)胞：由河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院提供并傳代培養(yǎng)維持。

制備姜黃揮發(fā)油：采用產(chǎn)于印度卡納塔克邦的姜黃根莖，打碎過(guò)40 目篩，使用離子液體[BMIM]PF6 酶法輔助提取得到的姜黃揮發(fā)油為橙黃色透明狀液體，且具備典型的姜黃氣味[21]。

制備姜黃揮發(fā)油儲(chǔ)備液：將制備得到的姜黃揮發(fā)油用0.1 %二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，且稀釋成不同的濃度備用。

RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素（雙抗）：Gibco 公司；胎牛血清：石家莊茂財(cái)生物科技有限公司；噻唑藍(lán)溴化四唑（methl thiazolyl tetrazolium，MTT）、5-氟尿嘧啶、芳姜黃酮（純度＞99.8%）、二甲基亞砜、吖啶橙：上海寶曼生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）：北京索來(lái)寶科技有限公司；膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司；多聚甲醛：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶紫：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（ar2140）：美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱（BPN-150CH）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IFD）：蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；離心機(jī)（LG10-2.4A 型）：北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；自動(dòng)控壓蒸汽滅菌鍋（D-1-70 型）：北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（EPOCH2 型）：美國(guó)博騰儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡（IX51）：日本奧林巴斯公司；流式細(xì)胞儀（accuriC6）：美國(guó) BD 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肺癌A549 細(xì)胞培養(yǎng)于由RPMI-1640 基本培養(yǎng)基：胎牛血清和雙抗以90 ∶10 ∶1 的質(zhì)量比配置成的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)即可消化傳代，取傳代至第2 代～4 代且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的A549 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化離心后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基將其調(diào)整至 5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，每孔 100 μL 接種于 96 孔培養(yǎng)板中。在 CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁完全后，吸去培養(yǎng)基，藥品組加入經(jīng)0.1%DMSO 稀釋成終濃度分別為25、50、100、200 mg/L 的姜黃揮發(fā)油培養(yǎng)液。陽(yáng)性對(duì)照組為80 mg/L 的5-氟尿嘧啶和50 mg/L 的芳姜黃酮。另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組（不加藥）和空白調(diào)零組（只加RPMI-1640 培養(yǎng)基），每組均設(shè)置6 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入 MTT 溶液（5g/L）20 μL，且調(diào)零組不加MTT，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸去培養(yǎng)基，在每孔加入150 μL 0.1%DMSO，搖床低速振蕩20 min至徹底溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm 波長(zhǎng)處各孔的吸光度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算公式為：

細(xì)胞增殖抑制率/%=（OD1-OD2）/（OD1-OD3）×100

式中：OD1為對(duì)照組的吸光度值；OD2為加藥組的吸光度值；OD3為空白調(diào)零組的吸光度值。

1.3.3 吖啶橙（acridine orange，AO）染色

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的A549 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化并稀釋細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL 接種到6 孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中孵育，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%左右時(shí)，更換培養(yǎng)基同時(shí)加入不同濃度姜黃揮發(fā)油（50、100、150 mg/L）1 mL/孔，并設(shè)置空白對(duì)照組和五氟尿嘧啶陽(yáng)性對(duì)照組。加藥處理24 h 后加入40 μL 30 mg/L 的吖啶橙AO 染液避光染色10 min 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照記錄[22]。

1.3.4 細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的A549 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化并稀釋到細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL 接種到6 孔板中，培養(yǎng)至貼壁24 h 后進(jìn)行加藥處理，設(shè)置姜黃揮發(fā)油的濃度梯度為 50、100、150 mg/L。孵育 48 h 后，加入 0.25%的胰酶進(jìn)行消化，收集每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞，且死細(xì)胞一并收集。用預(yù)冷的PBS 緩沖溶液沖洗兩次后，離心后棄上清液，加入100 μL 1×Binding Buffer 以重懸細(xì)胞，隨后加入 5 μL Annexin V-FITC 及 10 μL PI 工作液混勻，37 ℃避光孵育 15 min。再加入 400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放入冰上，樣品在1h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)[23]。

1.3.5 細(xì)胞遷移檢測(cè)

1.3.5.1 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

將細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL 的A549 細(xì)胞接種到6孔板，待單層長(zhǎng)滿(mǎn)后，使用20 μL 無(wú)菌微量移液器尖端在各孔細(xì)胞中間垂直畫(huà)一個(gè)“一”字。無(wú)菌的PBS 洗去脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清的RPMI-1640 基本培養(yǎng)基，藥品組分別加入終濃度為50、100、150 mg/L 的姜黃揮發(fā)油，陽(yáng)性對(duì)照組加入濃度為80 mg/L 的5-氟尿嘧啶，空白對(duì)照組用0.1%DMSO 處理。將6 孔板置于培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)0、48、72 h 后每孔選取3 個(gè)不同視野進(jìn)行顯微鏡拍照觀察。

傷口愈合率/%=（0 h 劃痕距離-48/72 h 劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100

1.3.5.2 集落形成試驗(yàn)

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的A549 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化并調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/孔，接種到6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后傾棄培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組加入濃度為80 mg/L的5-氟尿嘧啶，試驗(yàn)組分別加入濃度梯度為50、100、150 mg/L 的姜黃揮發(fā)油進(jìn)行處理，0.1%DMSO 作為空白對(duì)照組。孵育48 h 后吸出原培養(yǎng)基，用pH 6.8 的磷酸緩沖溶液洗滌2 次，加入無(wú)任何藥物的新鮮培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)液中pH 值的變化更換培養(yǎng)基。在第10 天時(shí)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，在溫度為25 ℃時(shí)用0.2%的結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡下記錄大于50 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，后按下式計(jì)算集落抑制率。

集落抑制率/%=（接種細(xì)胞數(shù)-集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

本文中所有試驗(yàn)均設(shè)置3 組平行。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)的比較采用（Oneway ANOVA）單因素方差分析，以P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞增殖的影響

姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of Curcuma longa L.volatile oil on A549 lung cancer cells

由圖1 可以看出，姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。同一藥物濃度下，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯。同一時(shí)間段內(nèi)，隨著藥物濃度增大，細(xì)胞增殖抑制率增加。當(dāng)加入姜黃揮發(fā)油濃度為200 mg/L，作用72 h 時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到72.93%。芳姜黃酮在姜黃揮發(fā)油中占39.37%，是姜黃揮發(fā)油中發(fā)揮抗腫瘤活性的主要成分[24-25]。本試驗(yàn)中50 mg/L 的姜黃揮發(fā)油與陽(yáng)性對(duì)照組50 mg/L 的芳姜黃酮對(duì)于細(xì)胞增殖抑制效果沒(méi)有顯著差異，進(jìn)一步證明了芳姜黃酮是姜黃揮發(fā)油中起主要抑制腫瘤增殖作用的有效成分。

2.2 吖啶橙染色

姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響見(jiàn)圖2。

由圖2A 可知，隨著加入姜黃揮發(fā)油濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量呈明顯的減少趨勢(shì)?？瞻捉M與加藥組相比具有完整的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核染色亮度均勻，且細(xì)胞核邊緣比較清晰。圖2B 顯示，姜黃揮發(fā)油促使癌細(xì)胞外形發(fā)生了新月形顆粒狀的變化，細(xì)胞膜出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞體變小、變圓甚至脫落。且細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)部分皺縮，細(xì)胞核濃聚、偏位[26]。經(jīng)150 mg/L 姜黃揮發(fā)油處理?xiàng)l件下的大部分癌細(xì)胞已經(jīng)凋亡且結(jié)構(gòu)被完全破壞?？梢?jiàn)姜黃揮發(fā)油對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞具有很好的凋亡誘導(dǎo)作用。

圖2 姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞的凋亡形態(tài)影響Fig.2 Effect of Curcuma longa L.volatile oil on apoptosis of A549 lung cancer cells

2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期

姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞凋亡周期的影響見(jiàn)圖3。

圖3 姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞凋亡影響Fig.3 Effect of Curcuma longa L.volatile oil on apoptosis of A549 lung cancer cells

由流式細(xì)胞散點(diǎn)圖可以看出姜黃揮發(fā)油抑制細(xì)胞增殖的可能性因素是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的主要特征是來(lái)自于細(xì)胞質(zhì)膜的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外化以及細(xì)胞中膜完整性的喪失[27]。由圖3a 看出，癌細(xì)胞由姜黃揮發(fā)油處理48 h 后表現(xiàn)出了4 種不同類(lèi)型的細(xì)胞群，活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞以及壞死的細(xì)胞[28]。隨著加藥濃度的增大，細(xì)胞的凋亡率也隨之增加。當(dāng)濃度為50 mg/L 時(shí)活細(xì)胞數(shù)比例為94.7%，凋亡率為5.2%。當(dāng)濃度增加至150 mg/L 時(shí)，活性細(xì)胞數(shù)下降至56.2%，但細(xì)胞凋亡率上升至43.8%。試驗(yàn)結(jié)果很好的證明了姜黃揮發(fā)油對(duì)于促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡起到了一定促進(jìn)的作用。

2.4 細(xì)胞遷移試驗(yàn)

2.4.1 劃痕試驗(yàn)

姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞劃痕傷口愈合率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞劃痕愈合的影響Fig.4 Effect of Curcuma longa L.volatile oilon scratch healing of A549 lung cancer cells

由圖4a 所示，加藥處理48 h 和72 h，各濃度姜黃揮發(fā)油均具有抑制細(xì)胞遷移作用，且時(shí)間越長(zhǎng)抑制作用越明顯?？瞻捉M細(xì)胞在72 h 時(shí)劃痕距離完全閉合，而經(jīng)150 mg/L 姜黃揮發(fā)油作用過(guò)的細(xì)胞，劃痕距離不僅沒(méi)有縮短，并且發(fā)生了細(xì)胞向兩邊遷移的現(xiàn)象，細(xì)胞間的間隙增大且明顯脫落。如圖4b 所示，細(xì)胞劃痕愈合率與加藥濃度呈劑量依賴(lài)性關(guān)系。與空白對(duì)照組相比，不同濃度姜黃揮發(fā)油處理均能顯著抑制細(xì)胞劃痕閉合率（P＜0.05），且加藥濃度越高，傷口愈合能力越低。

2.4.2 集落形成試驗(yàn)

姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 肺癌細(xì)胞集落形成的抑制作用見(jiàn)圖5。

圖5 姜黃揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞集落形成的影響Fig.5 Effect of Curcuma longa L.volatile oil on Cell Colony Formation

如圖5a 所示，為肺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞經(jīng)姜黃揮發(fā)油處理48h 后的集落形成情況，隨給藥濃度的升高，細(xì)胞集落形成率依次降低。圖5b 直觀的顯示了姜黃揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞抑制作用的定量分析，姜黃揮發(fā)油各濃度劑量組與對(duì)照組相比，對(duì)肺癌細(xì)胞集落形成均具有顯著抑制作用（P＜0.05）[29]。當(dāng)濃度為 150 mg/L 時(shí)，細(xì)胞集落增長(zhǎng)抑制率達(dá)到94.2%。集落形成的試驗(yàn)結(jié)果分析表明，姜黃揮發(fā)油可以顯著抑制人肺癌A549 細(xì)胞的增殖。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡，而由基因控制的細(xì)胞自主性的有序死亡，這與基因的激活、基因的表達(dá)以及基因調(diào)控等作用功能相關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂凋亡減少及突變細(xì)胞惡性增殖是癌癥發(fā)生的一個(gè)重要因素，故誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制癌細(xì)胞的增殖，是很多藥物阻礙腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制之一，也是預(yù)防和治療癌癥的有效途徑[30-32]。

近期對(duì)姜黃揮發(fā)油在癌癥方面的研究逐漸增加，作為一種天然的植物精油，其在多種腫瘤的防治過(guò)程中起到重要的作用[33]。本研究將姜黃揮發(fā)油作用于人肺癌A549 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能顯著的發(fā)揮抗癌作用并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性關(guān)系。通過(guò)MTT 試驗(yàn)考察了姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 細(xì)胞的存活率的影響，并且證實(shí)了芳姜黃酮是姜黃揮發(fā)油中發(fā)揮抗腫瘤效果的主要成分。AO 染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃揮發(fā)油作用在A549細(xì)胞后，能夠破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。流式細(xì)胞儀對(duì)其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡周期結(jié)果進(jìn)行分析，可以看出經(jīng)不同濃度的加藥處理后的A549 細(xì)胞，其早期和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量均有所增加。細(xì)胞遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃揮發(fā)油對(duì)A549 細(xì)胞的體外遷移能力具有明顯的抑制作用。姜黃的分布較廣泛，廉價(jià)易得，且姜黃揮發(fā)油的毒副作用小，這為進(jìn)一步探索抗腫瘤的新型候選藥物提供了可能性，為抗癌藥物的開(kāi)發(fā)與研究提供了依據(jù)。