傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料中乳酸菌的分離鑒定及篩選

胡楠，雷鳴，王遠(yuǎn)一飛，王俊平，王碩，2，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

乳酸菌是一種具有安全性且常用發(fā)酵食品的微生物[1]。乳酸菌能夠在適宜條件下快速繁殖、產(chǎn)酸，使發(fā)酵基質(zhì)的pH 值迅速降低，不僅有效抑制耐酸能力較差的微生物在發(fā)酵基質(zhì)中的生長繁殖，還能夠賦予發(fā)酵食品獨(dú)特的味道[2]。目前，乳酸菌被廣泛應(yīng)用于酸奶[3]、泡菜[4]、酸菜[5]和發(fā)酵型飲料[6]等發(fā)酵食品中。

傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料主要采用自然發(fā)酵的方式，利用水果果皮、環(huán)境或地域等天然存在的微生物作為發(fā)酵菌株[7]，通過微生物間的優(yōu)勝劣汰來完成發(fā)酵。其中，主導(dǎo)發(fā)酵的菌株多為乳酸菌[8]，但仍存在一些雜菌和少數(shù)致病菌，并且該方法存在發(fā)酵工藝不易控制和成品品質(zhì)參差不齊等缺點(diǎn)。近年來，研究人員采用直投菌種的方式實(shí)現(xiàn)發(fā)酵藍(lán)莓果汁[9]，但多采用商業(yè)化的菌株，缺少對(duì)其針對(duì)性的篩選。利用生物學(xué)手段從自然發(fā)酵的藍(lán)莓飲料中分離篩選出發(fā)酵性能優(yōu)異的菌株，對(duì)于產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制和安全性具有實(shí)際意義[10]，并可為后續(xù)研究發(fā)酵機(jī)理和功能成分代謝提供了理論基礎(chǔ)。

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料中分離和鑒定出乳酸菌，分析其產(chǎn)酸能力、耐受性能力和藍(lán)莓發(fā)酵過程中的生長能力，從而篩選出可用于發(fā)酵藍(lán)莓果汁的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料：黑龍江省伊春市。

MRS 培養(yǎng)基、MRS 肉湯：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒：TIANGEN 生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)生長曲線分析儀（FP-110-C）：芬蘭Bioscreen C 公司；數(shù)碼生物顯微鏡（DN-117M）：寧波永新光學(xué)股份有限公司；pH 計(jì)（FE-28）：瑞士梅特勒公司；高壓滅菌器（HVA-85）：日本 HIRAYAMA 公司；凝膠成像儀和電泳儀：美國Bio-Rad 公司；離心機(jī)（5804 R）：德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA 提取及16S rDNA 測(cè)序

傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司，采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）法[11]提取樣品DNA，以515F-806R 為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S V4 區(qū)，并進(jìn)行高通量測(cè)序文庫的構(gòu)建和Ion S5 XL平臺(tái)的單端測(cè)序。

1.3.2 乳酸菌的分離純化及保種

將傳統(tǒng)藍(lán)莓發(fā)酵飲料樣品等梯度稀釋后涂布于含有 2%碳酸鈣的 MRS 培養(yǎng)基[12]，37 ℃厭氧培養(yǎng)（48±2）h。挑取平板上具有溶鈣圈的菌落進(jìn)行三區(qū)劃線，重復(fù)3 次，得到純化菌株。將純化后的菌株接入MRS 肉湯中，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)。吸取10 μL 該菌液再接入MRS 肉湯中重復(fù)培養(yǎng)3 次后，進(jìn)行保種及菌種鑒定。

1.3.3 乳酸菌的鑒定與形態(tài)學(xué)分析

參照TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒[13]說明書進(jìn)行DNA 提取。以DNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，引物分別為27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）[14]。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將條帶清晰且單一[15]的PCR 產(chǎn)物送至金維智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)采用GenBank 中的 BLAST 進(jìn)行分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）[16]。

對(duì)鑒定后的菌株進(jìn)行菌落特征觀察和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[17]。

1.3.4 乳酸菌初篩

利用Geneious 軟件將乳酸菌純化菌株的16SrDNA序列與樣品高通量測(cè)序中所有聚類單元（operational taxonomic unit，OTU）代表序列進(jìn)行比對(duì)，選出與乳酸菌的OTU 代表序列匹配度為100%的菌株。

1.3.5 乳酸菌復(fù)篩

1.3.5.1 產(chǎn)酸試驗(yàn)

將初篩得到的菌種以5%的接種量接入MRS 肉湯中，厭氧培養(yǎng)24 h 后測(cè)定菌液pH 值，確定各菌株產(chǎn)酸能力。

1.3.5.2 胃液及膽汁耐受能力

參考Charteris 和Pacheco 等[18-19]方法測(cè)定胃液及膽汁耐受能力，略有改動(dòng)，具體方法如下：

取 1 mL 菌液，4 ℃、12 000 r/min 離心 5 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌2 次，將沉淀于1 mL 生理鹽水中充分混勻。在10 mL 人工胃液（pH 2.0）和10 mL 人工膽汁中分別加入100 μL 上述菌液，分別在37 ℃下孵育1 h 和2 h。參考GB/T 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)[20]。

1.3.6 乳酸菌生長曲線的繪制

參考劉書亮等[21]方法測(cè)定生長曲線，略有改動(dòng)，具體方法如下：

以5%的接種量將上述菌種分別接入MRS 肉湯中，轉(zhuǎn)至100 孔板中，利用全自動(dòng)生長曲線分析儀測(cè)定其生長曲線。37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h 測(cè)定吸光度（檢測(cè)波長600 nm）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.7 乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁終點(diǎn)活細(xì)胞計(jì)數(shù)

將乳酸菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以5%的接種量接入藍(lán)莓果汁中，于37 ℃靜置發(fā)酵。取發(fā)酵72 h 的發(fā)酵液進(jìn)行乳酸菌活細(xì)胞計(jì)數(shù)[22]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2016、SPSS Statistics 20.0 等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料的物種相對(duì)豐度

分析傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料中的微生物組成可以更好地控制生產(chǎn)工藝以及成品質(zhì)量，通過16S rDNA 高通量測(cè)序得到的傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料中細(xì)菌屬水平物種相對(duì)豐度如圖1 所示（僅展示相對(duì)豐度排名前十的物種）。

圖1 傳統(tǒng)藍(lán)莓發(fā)酵飲料屬水平物種相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of traditional fermented blueberry beverages at genus level

傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料屬水平物種相對(duì)豐度中只有乳桿菌屬（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）超過1%，說明其優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)明顯。Lactobacillus 在各樣品中的相對(duì)豐度介于65.4%～73.2%之間，均值為69.1%，相對(duì)豐度排名第一，菌群優(yōu)勢(shì)明顯。研究表明，Lactobacillus 是很多發(fā)酵食品中的主要發(fā)酵菌[3-6]。研究人員從發(fā)酵食品中分離得到該產(chǎn)品的主要優(yōu)勢(shì)菌并加以利用[23]，不但較大程度上還原了發(fā)酵食品的風(fēng)味而且在產(chǎn)品質(zhì)量上也得到較好的控制。Pseudomonas在各樣品中的相對(duì)豐度介于1.5%～12.1%之間，均值為8.5%，相對(duì)豐度排名第二，不是主要的發(fā)酵菌，可能在發(fā)酵過程中與發(fā)酵菌協(xié)同完成發(fā)酵，有報(bào)道稱其與Lactobacillus 為芥菜發(fā)酵過程中的主要微生物[24]，或者是由于成品低溫儲(chǔ)存時(shí)間過長導(dǎo)致其生長[25]。

2.2 菌落和菌體形態(tài)學(xué)分析

通過分離純化得到部分純化菌株菌落和菌體形態(tài)，如圖2 所示。

圖2 乳酸菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)圖Fig.2 The colony morphology and cell morphology of lactic acid bacteria

圖a 和b 中菌落為圓形，邊緣整齊，菌落中心隆起，菌落為白色，不透明，菌落周圍有明顯透明圈，說明菌落周圍的碳酸鈣被分解；圖c 中菌落呈白色，不透明，邊緣整齊，較為扁平；圖d、e 和f 中菌體均為短桿狀，菌體顏色為紫色，說明其均為革蘭氏陽性桿菌。

2.3 乳酸菌鑒定結(jié)果

以提取的純化菌株基因組DNA 為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3 所示。

圖3 乳酸菌PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR products electrophoretogram of inter-species primers of lactic acid bacteria

16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物在 1 000 bp～1 500 bp 之間，產(chǎn)物的電泳條帶單一且清晰，滿足測(cè)序要求。

經(jīng)過MRS 碳酸鈣平板劃線分離，共得到50 株疑似乳酸菌菌株。將50 株菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，確定測(cè)序菌株的種屬信息，結(jié)果匯總于表1。

表1 乳酸菌純化菌株16S rDNA 鑒定結(jié)果Table 1 Results of lactic acid bacteria identification by 16S rRNA gene sequence analysis

50 株疑似乳酸菌菌株均為乳桿菌屬（Lactobacillus），其中 25 株為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）；11 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；10 株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）；3 株短乳桿菌（Lactobacillus breris）；1 株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。本次分離鑒定得到的菌種在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中均有過相關(guān)報(bào)道，如姜雪晶等利用布氏乳桿菌通過混合發(fā)酵，可有效改善了酸菜成品品質(zhì)[26]。植物乳桿菌與人類的生活息息相關(guān)，常用于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中，其能夠通過消化道進(jìn)入腸道并定植從而發(fā)揮有益作用[27]。干酪乳桿菌能夠抑制和殺死食品中的許多腐敗菌和致病菌，并具有降膽固醇、抗腫瘤和提高人體抵抗力等益生功能[28]。由此可見，分離得到的菌種通過進(jìn)一步的篩選試驗(yàn)可作為發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵食品。

2.4 乳酸菌初篩

將上述50 株乳酸菌16S rDNA 序列與高通量測(cè)序得到的OTU 代表序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)。篩選與相對(duì)豐度排名前十的聚類單元代表序列匹配度為100%的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，篩選結(jié)果見表2。

表2 乳酸菌初篩結(jié)果Table 2 Results of lactic acid bacteria preliminary screening

共篩選出8 株乳酸菌，其菌株編號(hào)分別為：TUSTL4、TUST-L26、TUST-L27、TUST-L36、TUST-L51、TUSTL123、TUST-L129 和 TUST-L138。這 8 株乳酸菌將作為后續(xù)乳酸菌復(fù)篩試驗(yàn)的試驗(yàn)菌株。

2.5 乳酸菌生長曲線

為了直觀反應(yīng)乳酸菌純化菌株在培養(yǎng)基中的生長情況，對(duì)8 株乳酸菌進(jìn)行了生長曲線測(cè)定。圖4 展示了8 株乳酸菌在MRS 肉湯中培養(yǎng)18 h 內(nèi)OD600變化情況。

圖4 乳酸菌生長曲線Fig.4 The growth curve of lactic acid bacteria

從圖4 中可以看出，8 株乳酸菌均都在1 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在8 h～10 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期的OD600值均在 1.4～1.6 之間。

2.6 乳酸菌復(fù)篩

2.6.1 乳酸菌產(chǎn)酸能力

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸能夠改善產(chǎn)品口感和風(fēng)味，并能有效抑制耐酸性較差的微生物生長[29]，預(yù)防發(fā)酵過程中雜菌污染。因此，對(duì)8 株乳酸菌產(chǎn)酸能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果匯總于表3。

表3 乳酸菌產(chǎn)酸能力Table 3 Acid production quantity of lactic acid bacteria

續(xù)表3 乳酸菌產(chǎn)酸能力Continue table 3 Acid production quantity of lactic acid bacteria

由表3 可見，TUST-L27 的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，TUSTL26、TUST-L4 和TUST-L51 次之，其余菌株的產(chǎn)酸能力較弱，發(fā)酵液pH 值均在3.00～4.00 之間。

2.6.2 乳酸菌胃酸及膽汁的耐受性

在益生菌開發(fā)和使用過程中，對(duì)其耐胃酸和耐膽鹽能力的篩選具有重要意義，是益生菌能否產(chǎn)生益生作用的前提[30]。為此對(duì)8 株乳酸菌進(jìn)行了人工胃液及人工膽汁耐受試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 乳酸菌耐受人工胃液和膽汁的能力Table 4 Assessment of viability of lactic acid bacteria after exposure to simulating gastric juice and bile salts

TUST-L51、TUST-L4、TUST-L26 和 TUST-L274株乳酸菌對(duì)人工胃液具有一定耐受性，在人工胃液中孵育1 h 后，其存活率分別為0.10%、2.48%、0.65%、2.71%，其中TUST-L4 和TUST-L27 的存活率相對(duì)較高，略高于范穎等報(bào)道的植物乳桿菌TD109 的耐人工胃液能力[31]；其余4 株乳酸菌的存活率均小于0.01%。本研究中，不同乳酸菌在人工胃液中存活率差異較大，與Argyri 等[32]的研究結(jié)果相似。8 株乳酸菌在人工膽汁中孵育后，存活率均小于0.01%，說明其對(duì)人工膽汁中的耐受性較低，據(jù)Stuart 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的耐膽汁能力可通過馴化提高，在后續(xù)應(yīng)用過程中可通過菌株馴化增強(qiáng)其耐膽汁能力。

2.7 乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁的活細(xì)胞計(jì)數(shù)

考察乳酸菌在藍(lán)莓果汁中的生長能力。將8 株乳酸菌接入藍(lán)莓果汁中進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定72 h 時(shí)各菌株的活細(xì)胞數(shù)量，其計(jì)數(shù)結(jié)果見表5。

表5 乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁的活細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 5 Total lactic acid bacteria enumeration of fermented blueberry juice

發(fā)酵72 h 時(shí)，活菌數(shù)高于109CFU/mL 的菌株有TUST-L27、TUST-L4、TUST-L129 和 TUST-L138，其中，菌株 TUST-L27 最高；其余 4 株菌株（TUST-L123、TUST-L26、TUST-L36 和 TUST-L51） 的活菌數(shù)均低于109CFU/mL。

3 結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)藍(lán)莓發(fā)酵飲料樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）為主要發(fā)酵菌屬。進(jìn)一步利用微生物方法對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料中的乳酸菌進(jìn)行分離，共得到50 株乳酸菌。利用分子生物學(xué)手段對(duì)純化菌株進(jìn)行鑒定及初步篩選，有8株與傳統(tǒng)發(fā)酵藍(lán)莓飲料中相對(duì)豐度最高的乳酸菌聚類單元代表序列完全匹配。通過測(cè)定菌株生長曲線發(fā)現(xiàn)，8 株乳酸菌在MRS 培養(yǎng)基中均能在1 h 內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)期。TUST-L4、TUST-L26、TUST-L27 和 TUST-L514株乳酸菌具有較好的產(chǎn)酸能力和耐受性能力。TUSTL4、TUST-L27、TUST-L129 和 TUST-L1384 株乳酸菌在藍(lán)莓果汁發(fā)酵過程中具有較強(qiáng)的生長能力。綜上所述，注釋信息為植物乳桿菌的TUST-L4 和TUST-L27更適合應(yīng)用于發(fā)酵藍(lán)莓果汁。