南瓜均一多糖的分離純化及其抗氧化活性的研究

吳艷麗，邵珠領(lǐng)，張宇，*，王宇亮，趙芷萌

（1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江哈爾濱150070）

南瓜（Cucurbita moschata Duch），又被稱為番瓜、倭瓜、金瓜等，屬于葫蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，明代時(shí)期傳入中國(guó)，現(xiàn)在我國(guó)各地廣泛種植。南瓜亦可代糧食，又可供藥用，是傳統(tǒng)的藥食兩用植物，現(xiàn)代研究表明南瓜不僅富含氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)及淀粉等功能性成分，而且含有多種人體所需的鋅、鐵、硒等微量元素[1-3]，其中南瓜多糖是南瓜中重要的活性成分之一，具有較高的醫(yī)藥保健作用。

南瓜多糖作為一種天然提取產(chǎn)物，不僅具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，而且無(wú)毒副作用，有著廣泛的開(kāi)發(fā)前景[4-5]。王艷玲等[6]以水為提取溶液，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方法，確定了微波輔助提取南瓜多糖的最佳工藝。王傳棟等[7]通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，南瓜多糖不僅具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，還可提高紅細(xì)胞的免疫吸附功能。目前對(duì)南瓜多糖的研究主要集中在優(yōu)化南瓜多糖的提取工藝、探究多糖對(duì)高血糖高血脂的輔助治療及其作用機(jī)制、延緩和控制腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能等方面[8-11]，盡管已有對(duì)南瓜多糖抗氧化活性的報(bào)道[12]，但并未就其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行更深入的研究，特別是對(duì)南瓜均一多糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系研究較少。

因此，本試驗(yàn)以新鮮南瓜為原材料，通過(guò)提取、分離純化得到5 種均一多糖，通過(guò)測(cè)定其分子量、單糖組成，研究其與抗氧化活性之間的關(guān)系，為南瓜多糖抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系的研究提供科學(xué)依據(jù)，并對(duì)新型天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟南瓜：黑龍江省佳木斯市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥物化學(xué)教研室張宇教授鑒定為葫蘆科南瓜；AB-8 大孔吸附樹(shù)脂：東鴻化工有限公司；DEAE Cellulose-52 纖維素：英國(guó) Whatman 公司；Sephadex G-100 葡聚糖凝膠：美國(guó)GE Healthcare 公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；右旋糖苷葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH：美國(guó) Sigma 公司；抗壞血酸（VC）：南京建成生物工程研究所；三蒸水：佳木斯大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 型分析天平：上海恒平儀器有限公司；UV757 型紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2 電熱恒溫水浴鍋：余姚市遠(yuǎn)東數(shù)控儀器廠；LC-5510 高效液相色譜儀配備紫外檢測(cè)器：北京東西分析儀器有限公司；UM4800 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：上海通微分析技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 南瓜預(yù)處理

將新鮮成熟南瓜洗凈，去皮、去瓤、去籽，切成薄片后置于70 ℃烘箱中，12 h 后取出粉碎，過(guò)60 目篩，采用索氏提取法將粉碎后的南瓜粉用適量的95%乙醇80 ℃加熱回流提取4 h，提取液過(guò)濾，濾渣于60 ℃烘箱中過(guò)夜干燥，得到預(yù)處理后的南瓜粉，裝于自封袋內(nèi)，放于干燥器中備用。

1.3.2 南瓜多糖的提取

稱取一定量預(yù)處理后的南瓜粉，加入10 倍體積的蒸餾水，混合均勻后，在70 ℃、200 W 的超聲波下提取30 min，提取液過(guò)濾離心棄去沉淀，上清液減壓濃縮，加入95 %乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80 %，攪拌均勻后于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，離心（25℃，4 000 r/min，10 min）收集沉淀，沉淀加適量蒸餾水復(fù)溶后，再次減壓濃縮，真空冷凍干燥24 h，即得南瓜粗多糖。按以下公式計(jì)算南瓜粗多糖得率。

式中：m 為南瓜粗多糖質(zhì)量，g；M 為預(yù)處理后南瓜粉質(zhì)量，g。

取50 g 南瓜粗多糖配成10%的多糖溶液，采用Sevag 法脫蛋白[13]，重復(fù)操作6 次，合并多糖溶液減壓濃縮至一定體積流水透析48 h，透析袋內(nèi)液體減壓濃縮后真空冷凍干燥24 h，既得除蛋白后的南瓜多糖。稱5 g 脫蛋白后的多糖溶于100 mL 三蒸水中，25 ℃條件下4 000 r/min 離心10 min 后取上清液在已準(zhǔn)備好的AB-8 大孔樹(shù)脂柱上進(jìn)行上樣，吸附24 h 后用三蒸水進(jìn)行洗脫，采用α-萘酚-硫酸法進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，合并洗脫液，減壓濃縮、透析、冷凍干燥，即得脫色除雜后的南瓜多糖（Cucurbita moschata Duch polysaccharide，CMP）[14]。

1.3.3 南瓜多糖的分離純化

取 2 g CMP 溶于 100 mL 三蒸水中，離心（25 ℃，4 000 r/min，10 min）后取上清液在已備好的DEAE Cellulose-52 色譜柱上進(jìn)行分離，吸附12 h 后分別用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的 NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，用自動(dòng)接樣器收集洗脫液，流速為1 mL/min，5 mL/管，采用苯酚-硫酸法測(cè)定紫外吸光度值（490 nm），繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線分段合并，減壓濃縮后蒸餾水透析48 h，透析袋內(nèi)液體濃縮、冷凍干燥[15]。

分別稱取經(jīng)DEAE Cellulose-52 色譜柱分離得到的各組分0.3 g，溶于50 mL 蒸餾水中，離心后取上清液沿壁上樣于已備好的Sephadex G-100 色譜柱，吸附12 h 后用三蒸水洗脫，流速為0.5 mL/min，5 mL/管，采用苯酚-硫酸法隔管測(cè)490 nm 處的紫外吸光度值，繪制洗脫曲線，合并單一組分，減壓濃縮后蒸餾水透析48 h，冷凍干燥[16]。

1.3.4 南瓜多糖純度檢驗(yàn)及分子量測(cè)定

色譜條件：儀器：LC5510 高效液相色譜儀；檢測(cè)器：UM4800 蒸發(fā)光檢測(cè)器；色譜柱：Waters UltrahydrogelTM水溶性凝膠柱（7.8×300 mm）；流動(dòng)相：三蒸水；流速：0.8 mL/min；漂移管溫度：40 ℃；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

分別精密稱取10 mg 不同分子量（5 000、12 000、25 000、50 000、80 000、150 000 Da 和 270 000 Da）的右旋糖酐葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，加三蒸水定容于5 mL 容量瓶中，配置成濃度為2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過(guò)0.45 μm的水相微孔濾膜，取10 μL 按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，以色譜峰的保留時(shí)間（T）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)值（logMw）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程。分別稱取10 mg 經(jīng)Sephadex G-100 凝膠柱色譜純化得到的 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1 及CMP-D2 5 個(gè)組分，配制成2 mg/mL 的多糖樣品溶液，按上述方法操作，檢驗(yàn)其純度，并記錄得到單一對(duì)稱峰的保留時(shí)間，將其代入回歸方程，即得南瓜多糖的相對(duì)分子質(zhì)量Mw。

1.3.5 南瓜均一多糖的單糖組成分析

色譜條件為L(zhǎng)C5510 高效液相色譜儀，色譜柱：ODS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.7 mL/min；流動(dòng)相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液-乙腈 83 ∶17（體積比）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

取單糖對(duì)照品（甘露糖Man、鼠李糖Rha、葡萄糖醛酸GlcA、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara、巖藻糖Fuc）用三蒸水配制成濃度為40 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)品單糖混合溶液。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1，2-dihydropyrazol-3-one ，PMP）柱前衍生法[17]，取標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液1 mL 與0.5 mL 0.3 mol/L 的NaOH 溶液和0.5 mL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液渦旋混勻；于70 ℃水浴中反應(yīng) 1 h，取出冷卻至25 ℃，加0.5 mL 0.3 mol/L 的 HCL溶液終止反應(yīng)，加2 mL 三氯甲烷萃取3 次，棄氯仿層。水相過(guò)0.45 μm 微孔濾膜后，取10 μL 按上述色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，并將水相稀釋成7 種不同摩爾濃度（35、30、25、20、15、10、5 mmol/L） 的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，進(jìn)行HPLC 分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，摩爾濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性分析，得回歸方程。

分別取10 mg 南瓜均一多糖于安瓿瓶中，加4 mol/L 的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）4 mL，溶解后密封，121 ℃水解2 h，冷卻至25 ℃后加入甲醇溶液反復(fù)洗滌旋干以除去多余的TFA，加入1.5 mL 三蒸水使其溶解，離心取上清液，然后按上述PMP 法柱前衍生后進(jìn)行HPLC 分析。

1.3.6 體外抗氧化活性研究

1.3.6.1 南瓜均一多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用

取2 mL 不同濃度的南瓜均一多糖溶液于具塞試管中，加入0.2 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液2 mL，以蒸餾水作空白試驗(yàn)，并以相同濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，25 ℃避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，平行3 次試驗(yàn)取平均值[18]。南瓜均一多糖對(duì)DPPH自由基的清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為多糖溶液+DPPH 溶液的吸光度值；A2為多糖溶液+無(wú)水乙醇的吸光度值；A0為蒸餾水+DPPH 溶液的吸光度值。

1.3.6.2 南瓜均一多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

參照黃瓊等[19]的水楊酸比色法并改進(jìn)，取1 mL 不同濃度的南瓜均一多糖溶液于10 mL 試管中，加入0.5 mL 9 mmol/L 的 FeSO4溶液和 0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，最后加入0.5 mL 8.8 mmol/L 的H2O2試劑啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混勻后置于37 ℃的水浴中反應(yīng)30 min，冷卻至25 ℃，空白組以同等體積的蒸餾水代替樣品液測(cè)定吸光值，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，在510 nm 處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)取平均值。羥基自由基的清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A1為多糖+水楊酸-乙醇+FeSO4+H2O2的吸光度值；A2為多糖+水楊酸-乙醇+蒸餾水+H2O2的吸光度值；A0為蒸餾水+水楊酸-乙醇+FeSO4+H2O2的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用方差分析，p＜0.05 表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p＜0.01 表示差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜多糖的提取分離及純化結(jié)果

2.1.1 南瓜多糖的提取結(jié)果

以新鮮南瓜為原材料，采用超聲波輔助提取法一共提取3 kg 預(yù)處理后的南瓜粉，共得到347.62 g 南瓜粗多糖，得率為11.59%。

2.1.2 DEAE Cellulose-52 纖維素柱色譜分離結(jié)果

南瓜多糖（CMP）經(jīng)DEAE Cellulose-52 纖維素柱色譜進(jìn)行分離，采用不同濃度的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，得到以洗脫管數(shù)-吸光度值繪制的洗脫曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 DEAE Cellulose-52 色譜柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of pumpkin polysaccharide polysaccharides by DEAE Cellulose-52

根據(jù)洗脫曲線進(jìn)行分段合并，每段減壓濃縮，透析，冷凍干燥，得到6 個(gè)組分，分別命名為Fr.a1、Fr.a2、Fr.b、Fr.c、Fr.d、Fr.e。

2.1.3 SephadexG-100 凝膠柱色譜純化結(jié)果

選擇主要組分 Fr.a1、Fr.a2、Fr.b、Fr.c、Fr.d 過(guò)Sephadex G-100 凝膠柱色譜進(jìn)一步分離純化，得到7個(gè)組分，洗脫曲線如圖2 所示。

圖2 SephadexG-100 凝膠柱色譜洗脫曲線Fig.2 Elution curve of pumpkin polysaccharide polysaccharides by SephadexG-100

分段合并單一的對(duì)稱峰，各部分濃縮、透析、冷凍干燥，分別命名為 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMPC1、CMP-C2、CMP-D1、CMP-D2，本文選擇含量較大的5 個(gè)組分 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMPD2 為進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.2 多糖純度檢驗(yàn)及分子量測(cè)定結(jié)果

南瓜均一多糖高效液相色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 南瓜均一多糖高效液相色譜圖Fig.3 HPGPC chromatograms of pumpkin homogeneous polysaccharide

采用HPLC 法測(cè)得經(jīng)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂柱、DEAE Cellulose-52 纖維素柱和Sephadex G-100 凝膠柱色譜分離純化得到的CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 5 種南瓜多糖均呈現(xiàn)單一的對(duì)稱峰，且無(wú)雜質(zhì)峰，可證明其為均一多糖（見(jiàn)圖3b～圖3f）。由HPLC 法測(cè)得右旋糖苷葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為logMw=-0.938 1T+12.497 6，R2=0.998 6（見(jiàn)圖 3a）。將各樣品保留時(shí)間代入回歸方程得其分子量大小，見(jiàn)表1。

由表1 可知南瓜均一多糖的分子量范圍較大，在幾千到幾百萬(wàn)之間，其大小依次為CMP-A2＞CMP-B＞CMP-C1＞CMP-A1＞CMP-D2。

表1 南瓜均一多糖的保留時(shí)間和分子量Table 1 Retention time and molecular weight of pumpkin homogeneous polysaccharide

2.3 多糖的單糖組成測(cè)定結(jié)果

南瓜均一多糖樣品單糖組成的HPLC 圖見(jiàn)圖4。

圖4 南瓜均一多糖樣品單糖組成的HPLC 圖Fig.4 The HPLC chromatograms of component monosaccharides of pumpkin homogeneous polysaccharide

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖經(jīng)PMP 柱前衍生后進(jìn)行HPLC 分析，可得到9 種單糖的保留時(shí)間和峰面積（見(jiàn)圖4a），并對(duì)其進(jìn)行定量分析。CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1 及CMP-D2 5 種南瓜均一多糖經(jīng)TFA 水解并衍生后，進(jìn)行 HPLC 測(cè)定（見(jiàn)圖 4b～4f），將 5 種南瓜均一多糖的HPLC 色譜圖與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖進(jìn)行對(duì)照，可知，CMP-A1 由 Rha、Glc、Gal、Ara 組成，其摩爾比為 5.36 ∶47.51 ∶1.05 ∶1.00，不含糖醛酸；CMP-A2 由 GlcA、Glc、Gal、Ara 組成，其摩爾比為1.00 ∶2.93 ∶2.51 ∶1.96，糖醛酸所占摩爾比例為 11.90%；CMP-B 由 Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fuc 組成，其摩爾比為 4.78 ∶1.67 ∶1.00 ∶9.81 ∶6.78 ∶17.96 ∶13.63 ∶8.22，糖醛酸所占摩爾比例為 16.93%；CMP-C1由 Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fuc 組成，其摩爾比為 2.79 ∶2.31 ∶1.00 ∶8.52 ∶4.18 ∶4.64 ∶3.79 ∶7.16，糖醛酸所占摩爾比例為27.67 %；CMP-D2 由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fuc 組成，其摩爾比為4.89 ∶5.97 ∶1.00 ∶6.23 ∶5.68 ∶9.76 ∶4.85 ∶5.42，糖醛酸所占摩爾比例為16.51%。比較5 種南瓜均一多糖的糖醛酸含量，其大小依次為CMP-C1＞CMP-B＞CMPD2＞CMP-A2＞CMP-A1。

2.4 南瓜均一多糖體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 多糖對(duì)DPPH 自由基清除作用的測(cè)定結(jié)果

南瓜均一多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用見(jiàn)圖5。

圖5 南瓜均一多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.5 DPPH radical scavenging activities of pumpkin homogeneous polysaccharide

通過(guò)測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度并計(jì)算，由圖5可知，5 種南瓜均一多糖對(duì)DPPH 自由基均有一定的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增大其清除率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)多糖濃度為 4 mg/mL 時(shí)，CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 及 VC對(duì) DPPH 自由基的清除率分別為（41.45±1.57）%、（50.89±1.21）%、（58.73±1.02）%、（68.94±1.59）%、（59.78±2.03）%、（80.21±1.97）%。通過(guò)方差分析，可知CMP-B 和CMP-D2 對(duì)DPPH 自由基的清除作用具有差異性，但差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），其他各組兩兩相比，對(duì)DPPH自由基的清除作用均有極顯著性差異（p＜0.01）。通過(guò)曲線擬合函數(shù)，計(jì)算得到 CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 及 VC對(duì) DPPH 自由基的半抑制濃度（IC50）分別為（3.74±0.05）、（2.61±0.12）、（1.78±0.03）、（2.45±0.08）、（0.93±0.02）mg/mL，CMP-A1 對(duì) DPPH 自由基的清除率較低，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未達(dá)到IC50，通過(guò)比較IC50的大小可知，5 種南瓜均一多糖及VC對(duì)DPPH 自由基清除能力的強(qiáng)弱依次為：VC＞CMP-C1＞CMP-D2＞CMP-B＞CMP-A2＞CMP-A1。CMP-C1 與 CMP-B 相比，兩者的分子量比較接近，CMP-C1 的糖醛酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CMP-B 的糖醛酸含量，CMP-C1 對(duì)DPPH 自由基的清除率比CMP-B 高出10.21%；CMP-D2 與CMP-B相比，兩者糖醛酸含量相近，CMP-D2 的分子量顯著小于CMP-B 的分子量，但CMP-D2 對(duì)DPPH 自由基的清除率僅比CMP-B 高出1.05%。以上結(jié)果表明，南瓜多糖的糖醛酸含量對(duì)DPPH 自由基的清除作用影響較大，糖醛酸含量越高，其抗氧化活性越大；而分子量大小對(duì)其影響較小。

2.4.2 多糖對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定

南瓜均一多糖對(duì)羥基自由基的清除作用見(jiàn)圖6。

圖6 南瓜均一多糖對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.6 ·OH radical scavenging activities of pumpkin homogeneous polysaccharide

由圖6 可知，5 種南瓜均一多糖對(duì)羥基自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，且呈劑量依存關(guān)系，多糖質(zhì)量濃度越大，對(duì)羥基自由基的清除率越強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為 4 mg/mL 時(shí)，CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 及VC對(duì)羥基自由基的清除率分別為（56.78±2.16）%，（63.52±1.97）%，（71.32±1.71）%，（82.35±1.68）%，（73.28±1.03）%，（95.04±2.25）%。方差分析結(jié)果表明，CMP-B 和CMP-D2 對(duì)羥基自由基的清除作用具有顯著性差異（p＜0.05），其他各組兩兩相比，對(duì)羥基自由基的清除作用均具有極顯著性差異（p＜0.01）。擬合曲線方程，計(jì)算得 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMPC1、CMP-D2 及 VC對(duì)羥基自由基的 IC50分別為（3.32±0.14）mg/mL、（2.73±0.12）mg/mL、（2.01±0.08）mg/mL、（0.87 ±0.05） mg/mL、（1.68 ±0.09） mg/mL、（0.13 ±0.02）mg/mL，由 IC50可知，5 種南瓜均一多糖及 VC對(duì)羥基自由基的清除能力，由強(qiáng)到弱依次為：VC＞CMPC1＞CMP-D2＞CMP-B＞CMP-A2＞CMP-A1。CMP-C1 與CMP-B 相比，兩者的分子量大小相近，CMP-C1 的糖醛酸含量明顯高于CMP-B，CMP-C1 對(duì)羥基自由基的清除率比CMP-B 高出 11.03 %；CMP-D2 與 CMP-B相比，兩者的糖醛酸含量基本相等，CMP-D2 的分子量明顯小于CMP-B，但CMP-D2 對(duì)羥基自由基的清除率僅比CMP-B 高出1.96%。以上結(jié)果表明，多糖的糖醛酸含量對(duì)羥基自由基的清除作用影響較大，而分子量大小對(duì)其影響較小。

3 結(jié)論

采用超聲輔助法提取南瓜多糖，其粗多糖得率為11.59%，脫蛋白脫色后，經(jīng)纖維素DEAE Cellulose-52及凝膠Sephadex G-100 柱色譜分離純化得到CMPA1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 5 種多糖組分，采用高效液相色譜法鑒定為南瓜均一多糖，其分子量分別為（5.37×104）、（1.11×106）、（2.38×105）、（2.05×105）、（2.10×103）Da，糖醛酸所占摩爾比例分別為 0%、11.90%、16.93%、27.67%、16.51%。通過(guò) DPPH 法和水楊酸比色法檢測(cè)南瓜均一多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，5 種南瓜均一多糖在（0.5～4.0）mg/mL 濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH 及羥基自由基均有不同程度的清除作用，其清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大。

通過(guò)分析5 種南瓜均一多糖抗氧化活性與其分子量大小、糖醛酸含量之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：多糖的糖醛酸含量對(duì)其抗氧化活性影響較大，糖醛酸含量越高，其抗氧化活性越強(qiáng)，其作用機(jī)制可能是由于多糖中的糖醛酸基團(tuán)可以激活異頭碳上的氫原子，提高氫原子的供給能力，從而引起更強(qiáng)的抗氧化活性[20]。而分子量大小對(duì)其抗氧化活性的影響較小，相比高分子量的多糖，低分子量的多糖抗氧化活性更強(qiáng)一些，可能是由于低分子量的多糖糖鏈較短，結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，更易暴露出游離的羥基基團(tuán)，羥基基團(tuán)有利于自由基的清除，從而提高多糖的抗氧化活性[21]。該結(jié)果可為南瓜多糖構(gòu)效關(guān)系的研究提供相關(guān)參考依據(jù)，為天然抗氧化產(chǎn)品的原料篩選及其開(kāi)發(fā)利用提供新方向。