酪蛋白酶解反應(yīng)過程的近紅外光譜在線監(jiān)測(cè)技術(shù)研究

楊 雪 孔 娜 李云亮 王禹程 黃姍芬 馬海樂*

（1 承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北承德 067000

2 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013）

酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質(zhì)成分，約占牛奶總蛋白含量的80%以上[1]。酪蛋白經(jīng)酶解后的酶解產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)[2]、抗菌[3]、降血壓[4]和抗氧化[5]等生物學(xué)活性。酪蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)胃模擬消化后，其活性會(huì)有顯著的變化[6]。傳統(tǒng)的酶解過程中酶解產(chǎn)物及其模擬消化產(chǎn)物的活性檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高、無(wú)法實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)等，有必要引入一些新的檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)快速、在線監(jiān)測(cè)酶解反應(yīng)過程。

近紅外光譜在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)由于速度快、樣品信息完整，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，效率高等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于監(jiān)測(cè)食品加工過程中組成的變化。近紅外光譜反映物質(zhì)中主要與含氫基團(tuán)有關(guān)的內(nèi)部信息。物質(zhì)的近紅外光譜圖反映物質(zhì)的成分、濃度等與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)的性質(zhì)。Petiot等[7]通過在線檢測(cè)水分含量的變化來(lái)控制烤制食品的質(zhì)量；Muresa n等[8]使用近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)含油食品 （以向日葵為例）中的脂質(zhì)氧化進(jìn)行在線分析；Morgan等[9]在啤酒生產(chǎn)線上，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中酒精及糖分含量變化。上述研究結(jié)果都達(dá)到相應(yīng)的監(jiān)測(cè)及預(yù)測(cè)的效果。近紅外光譜在線監(jiān)測(cè)技術(shù)已廣泛用于監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)食品加工過程[10-11]，為實(shí)現(xiàn)食品加工過程的自動(dòng)化控制奠定了基礎(chǔ)[12-13]。然而，近紅外用于酶解反應(yīng)過程的監(jiān)測(cè)及其胃腸模擬消化產(chǎn)物的預(yù)測(cè)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本文探討近紅外光譜技術(shù)在線監(jiān)測(cè)酪蛋白酶解反應(yīng)過程，為酶解反應(yīng)終點(diǎn)的判斷提供技術(shù)支持，也為酶解產(chǎn)物胃腸模擬消化后的活性預(yù)測(cè)提供模型。

1 材料和方法

1.1 材料

酪蛋白，sigma公司；中性蛋白酶 （酶活2.0118×105U/mL，最適溫度 50℃，pH 7.0），購(gòu)于諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （Angiotensin-I-converting enzyme，ACE），根據(jù) Maruyama等[14]方法制備；N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-（2-fury lacryloyl）]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG），購(gòu)于Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

Tecan Infinite PRO TWIN 200多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯（TECAN）集團(tuán)公司；IKA-Dancing 自動(dòng)混勻器，德國(guó)IKA集團(tuán)有限公司；NIRQUEST256-2.5近紅外光譜儀，美國(guó)海洋光學(xué)；TP300浸入式光纖探頭，美國(guó)海洋光學(xué)；DH-2000-BAL UV-VIS-NIR光源，美國(guó)海洋光學(xué)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酪蛋白的酶解方法

稱取酪蛋白加入蒸餾水，配制成蛋白質(zhì)量濃度為5 g/L，50℃的水浴中攪拌平衡10 min，隨后加入5%（E/S）的中性蛋白酶開始酶解，整個(gè)酶解過程中保持pH和溫度恒定，酶解反應(yīng)300 min，每間隔5 min取樣1 mL（3份，其中一份用于酶解液直接測(cè)定ACE抑制活性，另兩份用于胃腸模擬消化），取樣后迅速用沸水浴滅酶10 min，冷卻后12 000 g離心10 min，收集上清液儲(chǔ)存于4℃下待測(cè)。取樣的同時(shí)，在反應(yīng)池中進(jìn)行在線光譜的采集。

2.2 胃、腸模擬消化

胃、腸模擬消化試驗(yàn)參照Ketnawa等[15]的方法略有修改，酶解結(jié)束后調(diào)節(jié)酶解液的pH為1.5，按照酶底比為2%（E/S）加入胃蛋白酶后，于37℃條件下模擬胃消化反應(yīng)2 h，然后取出于沸水浴條件下滅酶10 min，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH至7.0，離心取上清液待測(cè)。同時(shí)以同樣的方法模擬胃消化，反應(yīng)2 h結(jié)束后迅速調(diào)節(jié)其pH至7.5，按照酶底比為2%（E/S）加入胰酶后，于37℃反應(yīng)4 h模擬腸消化，反應(yīng)結(jié)束后于沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫，離心取上清液待測(cè)。

2.3 酪蛋白水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制率的測(cè)定

2.3.1 水解度（DH）的測(cè)定 酪蛋白酶解過程中DH的計(jì)算采用pH-stat方法[16]，其計(jì)算公式如下：

式中：h——被裂解的肽鍵數(shù)；htot——常數(shù)，即每個(gè)底物中蛋白中含有的肽鍵總數(shù)，酪蛋白為8.2 mmol/g[17]；B——消耗的堿液的體積，mL；N——堿液的濃度，mol/L；α——酪蛋白平均解離度[18]；m——底物中蛋白質(zhì)總含量，g。

2.3.2 蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率的測(cè)定 ACE抑制活性的測(cè)定方法采用酶標(biāo)儀法[19]。將蛋白水解物用 HEPES 緩沖液 （80 mmol/L，pH 8.3，300 mmol/L NaCl）稀釋200倍。加樣順序?yàn)?50 μL ACE，100 μL樣品稀釋液和 50 μL FAPPG（1.0 mmol/L）。加樣結(jié)束后迅速于340 nm處測(cè)定混合物吸光值。然后在37℃下孵育30 min后于340 nm再次測(cè)定樣品的吸光值。由HEPES緩沖液取代的樣品作為對(duì)照。ACE抑制活性通過以下公式計(jì)算：

式中，A——0 min時(shí)樣品的吸光值；B——30 min時(shí)樣品的吸光值。

2.4 酶解過程中在線光譜的采集及模型建立

以50℃蒸餾水為背景，每個(gè)樣品連續(xù)采集3次光譜，取其平均值作為該樣本的原始光譜，光譜圖見圖1。并采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）預(yù)處理方法對(duì)酶解過程中采集的原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。酪蛋白的DH、酶解液及其胃腸模擬消化產(chǎn)物的ACE抑制率的60個(gè)樣品離位化學(xué)值，分別分成校正集和預(yù)測(cè)集兩個(gè)部分。采用偏最小二乘算法（PLS）、區(qū)間偏最小二乘法（iPLS）和聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法（si-PLS）建立酶解過程中酪蛋白的DH、酶解液及其胃腸模擬消化產(chǎn)物的ACE抑制活性之間的定量模型。

圖1 酪蛋白酶解反應(yīng)的原始近紅外光譜圖Fig.1 Raw NIR spectra of casein during enzymatic reaction

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 酪蛋白DH、酶解產(chǎn)物及其胃腸模擬消化產(chǎn)物ACE抑制活性

酪蛋白DH、酶解產(chǎn)物及其胃腸模擬消化產(chǎn)物ACE抑制活性如圖2所示。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白DH逐漸增大。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液的ACE抑制率均增加，且經(jīng)過胃腸模擬消化以后的酶解液的ACE抑制活性顯著高于酶解液，說明胃腸道內(nèi)的消化酶也是制備ACE抑制肽的常用蛋白酶[20]。酶解液的ACE抑制率經(jīng)過胃消化后，活性均提高，而經(jīng)過腸消化后，在短時(shí)間內(nèi)ACE抑制活性提高，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE抑制活性反而降低，可能是因?yàn)槟c道內(nèi)的蛋白酶對(duì)胃酶解產(chǎn)物進(jìn)行過度酶解所致。胃腸模擬消化更能體現(xiàn)酶解液進(jìn)入胃腸道內(nèi)的ACE抑制活性。經(jīng)過近紅外光譜的在線監(jiān)測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)酶解過程終點(diǎn)的判斷，也可以預(yù)測(cè)酶解液進(jìn)入胃腸道內(nèi)的活性的變化。

圖2 酪蛋白DH（a）、酶解液及其胃腸模擬消化產(chǎn)物ACE抑制活性（b）Fig.2 The changes of DH of casein （a） and ACE inhibitory activity of its hydrolysate and gastrointestinal simulated digestion products （b）

3.2 酪蛋白DH的校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立

酪蛋白DH的校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立結(jié)果如圖3所示。利用PLS方法建立的定量模型如圖3a、圖3b，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.5781，RMSECV為2.45%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.961，RMSEP為1.64%。利用iPLS方法建立的定量模型如圖3c、圖3d、圖3e，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.6701，RMSECV為2.09%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.8316，RMSEP為2.31%。利用siPL方法建立的定量模型如圖3f、圖3g、圖3h，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.9028，RMSECV為1.23%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9513，RMSEP為1.94%。由結(jié)果可知，siPLS方法所建立的模型可良好地預(yù)測(cè)酪蛋白的DH。

3.3 酪蛋白酶解液的ACE抑制率校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立

圖3 酪蛋白DH的校正模型和預(yù)測(cè)模型Fig.3 Calibration and prediction model of DH of casein

酪蛋白酶解液的ACE抑制率的校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立結(jié)果如圖4所示。利用PLS方法建立的定量模型如圖4a、圖4b，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.771，RMSECV為3.6%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.8233，RMSEP為3.95%。利用iPLS方法建立的定量模型如圖4c、圖4d、圖4e，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.7616，RMSECV為5.65%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為 0.807，RMSEP為 5.2%。利用siPLS方法建立的定量模型如圖4f、圖4g、圖4h，校正模型的相關(guān)系數(shù)為 0.9493，RMSECV為2.73%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9656，RMSEP為2.4%。由結(jié)果可知，siPLS方法所建立的模型可良好地預(yù)測(cè)酪蛋白酶解物的ACE抑制率。

圖4 酪蛋白酶解液的ACE抑制率校正模型和預(yù)測(cè)模型Fig.4 Calibration and prediction model of ACE inhibitory activity of casein-hydrolysate

3.4 酪蛋白酶解液經(jīng)胃消化后的ACE抑制率校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立

酪蛋白酶解液經(jīng)胃消化后的ACE抑制率的校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立結(jié)果如圖5所示。利用PLS方法建立的定量模型如圖5a、圖5b，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.4409，RMSECV為9.37%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.7464，RMSEP為9.6%。利用iPLS方法建立的定量模型如圖5c、圖5d、圖5e，校正模型的相關(guān)系數(shù)為 0.693，RMSECV為7.57%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.8478，RMSEP為7.99%。利用siPLS方法建立的定量模型如圖5f、圖5g、圖5h。對(duì)于ACE，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.9483，RMSECV為3.32%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9717，RMSEP為3.37%。由結(jié)果可知，siPLS方法所建立的模型可良好地預(yù)測(cè)酪蛋白酶解物經(jīng)胃模擬消化后的ACE抑制率。

3.5 酪蛋白酶解液經(jīng)胃腸消化后的ACE抑制率校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立

圖5 酪蛋白酶解液經(jīng)胃模擬消化后的ACE抑制率校正模型和預(yù)測(cè)模型Fig.5 Calibration and prediction model of ACE inhibitory activity of casein-hydrolysate after gastric simulated digestion

酪蛋白酶解液經(jīng)胃腸消化后的ACE抑制率的校正模型和預(yù)測(cè)模型的建立結(jié)果如圖6所示。利用PLS方法建立的定量模型如圖6a、圖6b，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.4909，RMSECV為5.8%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9095，RMSEP為5.92%。利用iPLS方法建立的定量模型如圖6c、圖6d、圖6e，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.6909，RMSECV為4.64%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9079，RMSEP為4.82%。利用siPLS方法建立的定量模型如圖6f、圖6g、圖6h，校正模型的相關(guān)系數(shù)為0.9292，RMSECV為2.42%，預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9728，RMSEP為3.25%。由結(jié)果可知，siPLS方法所建立的模型可良好地預(yù)測(cè)酪蛋白酶解物經(jīng)胃腸模擬消化后的ACE抑制率。

圖6 酪蛋白酶解液經(jīng)胃腸模擬消化后的ACE抑制率校正模型和預(yù)測(cè)模型Fig.6 Calibration and prediction model of ACE inhibitory activity of casein-hydrolysate after gastrointestinal simulated digestion

4 結(jié)論

1）酪蛋白的水解度和酶解液的ACE抑制率均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，酶解液經(jīng)胃、腸模擬消化后ACE抑制率顯著升高。

2）采用si-PLS方法建立的模型具有很高的預(yù)測(cè)能力，可以實(shí)現(xiàn)酪蛋白酶解反應(yīng)過程的在線監(jiān)測(cè)，以及酶解液及其胃、腸模擬消化產(chǎn)物ACE抑制率的預(yù)測(cè)，為酶解反應(yīng)終點(diǎn)的判斷提供理論依據(jù)。