基于理性設(shè)計提高產(chǎn)微球莖菌AG1瓊膠酶的熱穩(wěn)定性

郭玉淅 高 賀 倪 輝 ，2，3，4 姜澤東 ，2，3，4 肖安風(fēng) ，2，3，4 朱艷冰 ，2，3，4*

（1 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門 361021

2 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室 福建廈門 361021

3 廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心 福建廈門 361021

4 廈門市南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點實驗室 福建廈門 361021）

瓊膠又稱瓊脂，是江蘺、紫菜和石花菜等紅藻的細(xì)胞壁的親水性多糖，由瓊脂糖和瓊脂膠組成[1]。瓊脂糖是一種由D-半乳糖和3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖經(jīng) α（1→3）和 β（1→4）糖苷鍵交替連接而成的鏈狀多糖，是形成凝膠的主要組分。瓊脂膠是一種非凝膠組分，具有與瓊脂糖類似的多糖鏈狀結(jié)構(gòu)，含有多種取代基，如硫酸酯、丙酮酸乙縮醛、甲基等。瓊膠酶能催化水解瓊脂糖分子內(nèi)的糖苷鍵，產(chǎn)生瓊膠寡糖?；谒呋擒真I的類型差異，瓊膠酶分為兩大類：α-瓊膠酶（E.C.3.2.1.158）和β-瓊膠酶（E.C.3.2.1.81），前者作用于瓊脂糖的α-1，3 糖苷鍵，產(chǎn)物是以 3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖；后者作用于瓊脂糖的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)物是以D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖[2-3]。瓊膠寡糖水溶性好，易于為人體吸收，具有多種生理功能，如抑菌、抗氧化、抗癌、美白、保濕、益生元等[4-7]。瓊膠酶作為一種重要的工具酶，可以制備瓊膠寡糖，用于海藻多糖結(jié)構(gòu)研究，水解瓊脂糖凝膠并從中回收DNA和RNA，以及制備海藻單細(xì)胞和原生質(zhì)體，被廣泛應(yīng)用于食品、制藥和日用化工等領(lǐng)域。

瓊膠酶主要存在于海洋微生物和一些海洋軟體動物的消化道內(nèi)[8]。瓊脂的熱溶液在43℃以下就能凝固形成凝膠[9]。瓊脂溶液具有較高的黏度，其隨著溫度的降低逐漸增加。研究具有良好熱穩(wěn)定性的瓊膠酶，對于瓊膠的利用具有重要意義。

在先前的研究中，從產(chǎn)微球莖菌AG1（Microbulbifer sp.AG1）中克隆得到瓊膠酶基因[10]，它的GenBank登錄號為KU049031。為獲得熱穩(wěn)定性高的瓊膠酶，本文采用理性設(shè)計方法獲得瓊膠酶突變體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含菌株AG1瓊膠酶基因的重組質(zhì)粒和大腸桿菌（E.coli）BL21由實驗室保存；原核表達(dá)載體pGEX-6P-1為Novagen產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI，為TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；柱式DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，購買自天根生化科技（北京）有限公司；寡核苷酸引物的合成及核酸序列的測定均由華大基因（上海）股份有限公司完成；Glutathione sepharose 4B，GE Healthcare Life Sciences公司產(chǎn)品；瓊脂糖，購于美國Hydragene公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 ZHWY-2102雙層全溫度恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；Mastercycler gradient PCR儀，德國Eppendorf公司；5810R冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；UV-5200紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；XMTD-8222數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提高產(chǎn)微球莖菌AG1瓊膠酶熱穩(wěn)定性位點的選取 使用PoPMuSiC-2.1在線分析工具[11]（http：//dezyme.com/）分析菌株AG1瓊膠酶序列，在線計算瓊膠酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化，選擇去折疊自由能顯著減少的氨基酸作為突變位點。經(jīng)分析選擇D136N作為突變位點，設(shè)計擴(kuò)增D136N基因的引物，序列如表1所示。

表1 突變體D136N的特異性引物Table1 The specific primers for mutant D136N

1.2.2 突變體D136N基因的獲得 采用重疊延伸PCR獲得突變體基因。分別以P1和P4、P2和P3為引物，以含有瓊膠酶基因的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，條件為95℃5 min預(yù)變性；94℃45 s，50℃45 s，72℃60 s，30 個循環(huán)；72℃延伸5 min，回收并純化PCR產(chǎn)物。取上述兩輪PCR純化產(chǎn)物，加入引物P1和P2擴(kuò)增全基因片斷。最后回收并純化PCR產(chǎn)物，獲得突變體基因。

1.2.3 含突變體D136N基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將突變基因和質(zhì)粒PGEX-6P-1分別進(jìn)行BamHI和XhoI的雙酶切反應(yīng)，酶切后的基因片段和表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基。37℃過夜培養(yǎng)，選取菌落PCR陽性的克隆子，并進(jìn)行測序，確認(rèn)插入序列。

1.2.4 突變瓊膠酶在大腸桿菌（E.coli）中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將含有突變體基因的陽性克隆單菌落37℃過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為0.8，加入IPTG至終濃度0.05 mmol/L，22℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h后，4℃、5 000×g離心 20 min，棄上清，菌體用預(yù)冷的PBS緩沖液 （140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 7.3）重懸，在冰浴條件下超聲破菌后，4℃、12 000×g離心20 min，獲得的上清液即粗酶液。參照Glutathione sepharose 4B的使用說明書，采用親和層析純化重組蛋白。蛋白質(zhì)的純度及分子質(zhì)量利用SDS-PAGE分析。利用BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。

1.2.5 瓊膠酶活力的測定 酶活力測定采用DNS法[12]。取580 μL含 0.3%瓊脂糖的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5），加入 20 μL 瓊膠酶（質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），60℃反應(yīng)30 min后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。加入900 μL DNS試劑，混勻后沸水浴10 min，冷卻后加蒸餾水定容至5 mL，于540 nm波長下測定吸光值。瓊膠酶活力定義為，在上述條件下，每分鐘能夠水解底物釋放1 μmoL還原糖（以D-半乳糖計）所需的酶量。

1.2.6 溫度對瓊膠酶的影響 分別在不同溫度（30，40，50，60，70和 80℃）下檢測酶的活力，并以最高酶活力為100%，研究酶的最適反應(yīng)溫度。將酶分別置于不同溫度（40，50，60和70℃）下分別放置10～60 min后，測定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7 pH對瓊膠酶的影響 分別用不同pH緩沖液配置0.3%的瓊脂糖底物溶液，并測定酶的活力，以最高酶活力為100%，研究酶的最適反應(yīng)pH。所用的緩沖液為50 mmol/L C6H8O7-Na2HPO4緩沖液（pH 4.0～7.0），50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0～9.0），50 mmol/L 甘氨酸-NaOH 緩沖液（pH 9.0～10.0）。將酶分別置于不同pH的緩沖液中，25℃放置1 h后，測定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.8 動力學(xué)參數(shù)的測定 分別配制不同濃度的瓊脂糖溶液 （0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.6和 0.8 mg/mL），測定酶在不同底物濃度下的酶活力。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算酶的動力學(xué)參數(shù)，包括 Km，Vmax，kcat和 kcat/Km。

1.2.9 酶的結(jié)構(gòu)分析 利用SWISS-MODEL進(jìn)行瓊脂酶的三維模建，使用PyMOL軟件顯示并分析酶的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 溫度對突變體D136N活性及穩(wěn)定性的影響

在不同溫度下測定酶的活力，結(jié)果（圖1）顯示，突變體D136N與野生型同樣在60℃下表現(xiàn)出最大活力。突變酶在40～70℃的溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)70%以上的相對活力，與野生型相比，突變體D136N在較低溫度下表現(xiàn)出更高的酶活力。

酶的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果見圖2。突變體D136N在40，50和60℃熱處理1 h后還能保持相對穩(wěn)定，能夠保持超過85%的活力。野生型在50和60℃處理1 h，能分別保持約66%和19%的相對酶活力。突變酶與野生型在70℃下溫育10 min都基本失去活力。這些結(jié)果表明，突變體D136N相比野生型瓊膠酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖1 突變體D136N和野生型瓊膠酶的最適作用溫度Fig.1 The optimum temperature of the mutant D136N and wild-type agarase

圖2 溫度對突變體D136N和野生型瓊膠酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the thermostability of the mutant D136N and wild-type agarase

2.2 pH對突變體D136N活性及穩(wěn)定性的影響

突變體D136N與野生型酶的最適反應(yīng)pH均為7.5（圖3a）。突變酶在pH 6.0～9.0之間保持了較高的活力，具有最高活力的60%以上，在pH 4.0和10.0條件下，酶活力基本喪失。pH穩(wěn)定性分析結(jié)果（圖3b）顯示，與野生型酶相似，突變體D136N在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，25℃處理1 h后仍能夠保持高于80%的活力，但是在pH 10.0的條件下處理后酶穩(wěn)定性迅速下降。

圖3 pH對突變體D136N和野生型瓊膠酶的活性（a）和穩(wěn)定性（b）的影響Fig.3 Effect of pH on the activity （a） and thermostability （b） of the mutant D136N and wild-type agarase

2.3 突變體D136N的動力學(xué)參數(shù)

以瓊脂糖為底物測定酶的動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果如表2所示，與野生型相比，突變體D136N的Km值和kcat值增大，Vmax值略微增加，kcat/Km值降低。說明突變體D136N對瓊脂糖的親和能力下降，催化效率也有所降低。

表2 野生型和突變體D136N的動力學(xué)參數(shù)Table2 Kinetic parameters for wild-type enzyme and mutant enzyme of D136N

2.4 瓊膠酶的結(jié)構(gòu)分析

酶的結(jié)構(gòu)分析顯示，野生型瓊膠酶的Asp136與Asn255形成兩個氫鍵，與Tyr282形成一個氫鍵（圖4a）。突變后的Asn136和Asn255形成3個氫鍵，與Tyr282形成一個氫鍵，還與Ala134形成一個氫鍵（圖4b）。因此突變后的136位氨基酸能夠與周圍氨基酸形成更多的氫鍵。

圖4 突變位點引起的氫鍵變化Fig.4 Hydrogen bonds changes caused by the mutant site

3 討論

蛋白質(zhì)的理性設(shè)計是在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識的基礎(chǔ)上，采用定點突變技術(shù)改變蛋白質(zhì)中的個別氨基酸殘基，使蛋白質(zhì)的性質(zhì)向著既定的方向改變[13-14]。本文基于理性設(shè)計，采用重疊延伸PCR技術(shù)，通過將Asp136突變?yōu)锳sn136，獲得熱穩(wěn)定性預(yù)計提高的突變體D136N。

將突變體D136N進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化，得到突變瓊膠酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。與野生型酶相比，突變體D136N對瓊脂糖的親和能力下降，催化效率也有所降低。突變酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH與野生型相同。突變體D136N在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，在 40，50和 60℃，該突變酶的熱穩(wěn)定性好于野生型酶。這些性質(zhì)提高了該突變酶在工業(yè)應(yīng)用上的價值，使其在實際生產(chǎn)應(yīng)用中具有良好前景。

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與帶電荷殘基、疏水氨基酸殘基、鹽鍵、氫鍵、疏水相互作用等因素有關(guān)[15-18]。氫鍵是通過氫原子參與成鍵的特殊形式的化學(xué)鍵，是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要作用力之一。Zhu等[19]和Zhou等[20]通過定向進(jìn)化獲得了熱穩(wěn)定性的酶，對于這些酶突變位點的微觀結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，突變體相較于野生型在突變位點附近都產(chǎn)生了新的氫鍵。本文中，相較于野生型酶，突變體D136N在136位的氨基酸形成的氫鍵增加2個。增加的氫鍵可能更有利于維持產(chǎn)微球莖菌AG1瓊膠酶的結(jié)構(gòu)，使其具有更好的熱穩(wěn)定性。