調(diào)控miR-495、P4HA2的表達(dá)對(duì)肝纖維化和肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制研究*

張紅宇 李 娟 余祖江 江河清 梁紅霞 武淑環(huán)

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科 (河南 鄭州， 450052)

肝細(xì)胞癌在常見腫瘤的發(fā)病率中排第5位，同時(shí)也是和癌癥相關(guān)死亡的第三大病因[1]。目前肝細(xì)胞癌的臨床預(yù)后仍然較差，3年內(nèi)復(fù)發(fā)率可高達(dá)50%[2]。 除腫瘤病變的異質(zhì)性外，還與肝細(xì)胞癌主要由慢性病毒性肝炎或肝硬化導(dǎo)致相關(guān)[3]。肝纖維化是由各種慢性肝損傷引起的病理變化的結(jié)果。由于持續(xù)的肝細(xì)胞損傷、炎癥、壞死、異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠原沉積，慢性肝炎的發(fā)生最終導(dǎo)致肝硬化[4，5]。然而，肝細(xì)胞癌發(fā)展過程中ECM膠原沉積的重要性尚未得到充分證實(shí)。脯氨酰4-羥化酶亞基α-1(P4HA2)是膠原生物發(fā)生的關(guān)鍵酶。miRNA通過與靶mRNA內(nèi)的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合而影響真核細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，miRNA參與多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡的過程[6]。 先前的證據(jù)表明miR-495在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)較癌旁正常的肝組織顯著下調(diào)[7]。然而，miR-495在肝細(xì)胞癌中的作用知之甚少。我們研究了miR-495和P4HA2在肝硬化和肝癌細(xì)胞發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-495可以通過直接靶向P4HA2 mRNA 的3’-UTR來(lái)抑制P4HA2的表達(dá)，而低氧條件下通過下調(diào)miR-495的表達(dá)來(lái)促進(jìn)P4HA2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌中ECM膠原的沉積，參與肝纖維化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 組織與細(xì)胞 臨床肝細(xì)胞癌組織及其相應(yīng)的非腫瘤肝組織(28例份)。取得患者知情同意書，同意將其手術(shù)組織用于本研究。研究方案經(jīng)醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人肝癌細(xì)胞系HepG2維持在DMEM培養(yǎng)基中(Gibco，CA，USA)，同時(shí)補(bǔ)充10%的熱滅活的胎牛血清(Gibco，CA，USA)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml的鏈霉素，置于含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。正常氧條件為20% O2，低氧條件為1%O2。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 將人P4HA2基因的全長(zhǎng)cDNA克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中以產(chǎn)生pcDNA3-P4HA2。將P4HA2 mRNA的3’-UTR中含有miR-495的靶位點(diǎn)的片段亞克隆到pGL3-對(duì)照載體中以產(chǎn)生pGL3-P4HA2-wt，突變靶位點(diǎn)以產(chǎn)生pGL3-P4HA2-mut。構(gòu)建引物如下：pcDNA3-P4HA2(正向)，5’-CTAGCTAGCATGATCTGGTA-TATATTAATT-3’，(反向)5’-CCGCTCGAGTCATTCCAATTCTG ACAACGT-3’;pGL3-P4HA2-wt(正向)5’-GCTCTCGA-CAGGAGTTTACAATTGAC-3’，(反向)5’-GGGGGCCGGCCAAGG-CATTTGTTTCCTATCA-3’;pGL3-P4HA2-mut(正向)5’-GCTCTCGACAGGATCC-TGTAATTGAC-3’，(反向)5’-GGGGGCCGGCCAAGGCATTTGTTTCCTATCA-3’。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞在6孔或24孔板中培養(yǎng)24 h，然后用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行所有質(zhì)粒miRNA或siRNA轉(zhuǎn)染。P4HA2 siRNA寡核苷酸和非特異性對(duì)照(si-對(duì)照)，miR-495(或抗miR-495)，miRNA對(duì)照和抗miRNA的對(duì)照都由廣州銳伯公司合成。P4HA2的siRNA序列如下：si-P4HA2-1，5’-ATTTGAGCT-ATGCGGTATATCdTdT-3’; si-P4HA2-2, 5’-CCTGTGGTGTCTCGAA-TTAATdTdT-3’。

1.4 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 將細(xì)胞接種到24孔板中(每孔3×104個(gè)細(xì)胞)。24 h后，用含有Renilla螢光素酶基因的pRL-TK質(zhì)粒(每孔50 ng)和含有P4HA2 3’-UTR的種子序列或突變種子序列的各種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(每孔100 ng)。在轉(zhuǎn)染后48 h，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，并使用pRL-TK對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用Trizol從細(xì)胞(或組織)中提取總RNA。對(duì)于成熟的miR-495的檢測(cè)，通過poly(A)聚合酶對(duì)總RNA進(jìn)行多聚腺苷酸化，使用ImPro-Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI，USA)對(duì)含poly(A)尾的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)所述方法進(jìn)行qRT-PCR。使用的引物如下：P4HA2(正向)5’-GGCAGCCAAAGCTCTGTTAC-3’(反向)，5’-AAAGCAGTCCT-CAGCCGTTA-3’;GAPDH正向，5’-ATCACCATCTTC CAGGAGCGA-3’，(反向)5’-CCTTCTCCAT GGTGGTGAAGAC-3’;miR-495(正向)5’-TGTAAACATCCTTGACTGGAAG-3’，(反向)5’-GCGAGCACAGAATTAATACG-AC-3’;U6(正向)5’-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3’，(反向)5’-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3’。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，將膜與用于小鼠抗β-actin，兔抗-P4HA2的一抗孵育。然后，在室溫下用PBS-T稀釋的二抗孵育1 h。在PBS-T中洗滌膜，并通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)Western Blotting Detection Reagents檢測(cè)結(jié)合的抗體。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種在24孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后，使用能摻入檢測(cè)細(xì)胞的EdU細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒。將細(xì)胞與50 μmol/L EdU一起孵育2 h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%Triton透化后進(jìn)行EdU染色。在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 收集的數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，3組及以上之間比較采用單因素方差分析。miR-495與P4HA2的相關(guān)性分析使用皮爾遜相關(guān)性檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 miR-495抑制P4HA2的表達(dá)情況 使用Targetscan，Miranda和Pictar篩選miR-495的靶基因，發(fā)現(xiàn)P4HA2是miR-495的靶基因之一。見圖1。

圖1 miR-495抑制P4HA2的表達(dá)圖

A:miR-495在P4HA2 mRNA 的3’ UTR中的結(jié)合位點(diǎn)，B:克隆了P4HA2的mRNA(或它的突變體)的3’-UTR到pGL3熒光素酶報(bào)告基因載體(命名為pGL3-P4HA2-wt或pGL3-P4HA2-muT);C:螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示miR-495顯著抑制了HepG2細(xì)胞中pGL3-P4HA2-wt的熒光素酶活性，并且是劑量依賴性地抑制，但不能抑制pGL3-P4HA2-mut的熒光素酶活性；D：通過抗miR-495抑制內(nèi)源性的miR-495表達(dá)可以增加pGL3-P4HA2-wt的熒光素酶活性，但不能改變P4HA2-mut的熒光素酶活性。

2.2 miR-495抑制HepG2細(xì)胞中的P4HA2表達(dá)情況 我們?cè)贖epG2細(xì)胞中進(jìn)行了miR-495的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。見圖2。

圖2 miR-495抑制HepG2細(xì)胞中的P4HA2表達(dá)圖

A：miR-495的過表達(dá)能夠在HepG2細(xì)胞中以劑量依賴性方式抑制P4HA2的mRNA和蛋白水平的表達(dá)；B：當(dāng)內(nèi)源性miR-495被抗miR-495下調(diào)時(shí)，HepG2細(xì)胞中P4HA2的表達(dá)增加。

2.3 低氧條件下下調(diào)miR-495表達(dá)水平促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖的情況 EdU檢測(cè)表明，用miR-495處理時(shí)HepG2細(xì)胞增殖減少，但過表達(dá)P4HA2可以挽救miR-495介導(dǎo)的增殖減少。見圖3。

圖3 低氧條件下miR-495促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖圖

A：P4HA2 siRNA的共轉(zhuǎn)染能夠抑制抗miR-495誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖加速。結(jié)果表明miR-495通過P4HA2抑制肝癌細(xì)胞的增殖。B:HepG2細(xì)胞置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)，qPCR檢測(cè)結(jié)果表明低氧條件下HepG2細(xì)胞中miR-495的表達(dá)顯著低于正常組，而P4HA2的表達(dá)顯著高于正常組。低氧組HepG2細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加。C：低氧組中過表達(dá)miR-495可以明顯逆轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞的增殖，與正常組沒有顯著差異。

2.4 miR-495與臨床肝細(xì)胞癌組織中的P4HA2相關(guān)性 我們使用qRT-PCR分析驗(yàn)證了28個(gè)臨床配對(duì)的肝細(xì)胞癌和相鄰的腫瘤周圍組織中miR-495和P4HA2 mRNA之間的關(guān)系，結(jié)果表明miR-495的水平與P4HA2的mRNA的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.683，P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-495與臨床肝細(xì)胞癌組織中的P4HA2相關(guān)性圖

A：P4HA2 mRNA的表達(dá)在肝細(xì)胞癌樣本中顯著高于癌旁正常組織；B：miR-495水平與P4HA2的mRNA水平的相關(guān)性

3 討論

肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多個(gè)通路和多個(gè)基因的分子改變的活化。已經(jīng)證明miRNA在多種生物過程中起重要作用，通過不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過直接調(diào)節(jié)靶基因的mRNA表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的發(fā)展，其中miR-495在肝細(xì)胞癌中下調(diào)[8,9]。然而，miR-495在肝細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制知之甚少。我們研究了miR-495在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制。

首先，我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了miR-495的靶基因。P4HA2是miR-495的靶基因之一，涉及癌癥發(fā)展過程中的膠原蛋白合成。我們的結(jié)果表明在肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞miR-495能夠直接靶向到P4HA2 mRNA的3’-UTR。此外，qRT-PCR和Western Blot分析表明，HepG2細(xì)胞中miR-495可以下調(diào)P4HA2的表達(dá)水平，這一結(jié)果也支持P4HA2是miR-495的靶基因之一。P4HA2是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白合成所需的關(guān)鍵酶。ECM為細(xì)胞提供物理框架，并啟動(dòng)關(guān)鍵細(xì)胞事件，如粘附、遷移、增殖、分化和存活[10]。 膠原蛋白是人體中最豐富的蛋白質(zhì)，為ECM提供支架。膠原蛋白包含大量結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，每個(gè)蛋白質(zhì)含有通過重復(fù)GXY序列形成獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)(其中G是甘氨酸，X通常是脯氨酸或賴氨酸，Y通常是羥脯氨酸)。P4HA2受到許多分子的調(diào)節(jié)。例如，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1能增加缺氧條件下纖維細(xì)胞中P4HA2的表達(dá)，導(dǎo)致膠原蛋白沉積增加。IL-6通過RAF-MEK1/2 - ERK1/2 - MAPK和c-Jun通路下調(diào)P4HA2的表達(dá)，導(dǎo)致小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定[11]。

缺氧作為一種細(xì)胞刺激，能促進(jìn)組織纖維化。在癌癥中，腫瘤內(nèi)缺氧與侵襲、轉(zhuǎn)移、治療失敗和患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)和HIF-2是細(xì)胞適應(yīng)低氧條件的關(guān)鍵介質(zhì)。HIF-1是異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由組成型表達(dá)的HIF-1β亞基和O2調(diào)節(jié)的HIF-1α亞基組成。在低氧條件下，HIF-1α蛋白是穩(wěn)定的，與HIF-1β二聚化，并激活多個(gè)下游靶基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。我們將HepG2細(xì)胞置于低氧環(huán)境中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)低氧能誘導(dǎo)miR-495的表達(dá)下調(diào)、P4HA2的表達(dá)上調(diào)，并且促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖，因此我們認(rèn)為低氧環(huán)境可能通過調(diào)節(jié)miR-495和其靶基因P4HA2的表達(dá)，進(jìn)而參與了肝組織中膠原蛋白的沉積，最終影響了肝纖維化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。此外，miR-495參與多種其他腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，如食道癌、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌[13]。這些結(jié)果表明miR-495在癌癥發(fā)生中起重要作用。P4HA2介導(dǎo)的膠原蛋白和ECM的沉積伴隨腫瘤進(jìn)展[14]。臨床肝細(xì)胞癌樣品中，miR-495的表達(dá)水平與P4HA2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果都支持我們分析的機(jī)制，并為miR-495在肝癌發(fā)生中的作用提供了新的佐證。miR-495或P4HA2可以作為肝癌中有希望的治療靶標(biāo)。