單核苷酸多態(tài)性與慢性HBV感染結(jié)局相關(guān)性分析

王朝輝 李 瑋

青島市第六人民醫(yī)院肝病科 (山東 青島， 266071)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是指有乙型病毒性肝炎或HBsAg陽性史超過6個月，且HBV DNA仍然為陽性者。慢性HBV感染嚴(yán)重危害人體健康，全國約有1.1億人攜帶HBV，每年約有99萬人死于HBV感染[1,2]。不同人群接觸HBV，會產(chǎn)生不同的疾病表現(xiàn)和癥狀，部分人群為自限性感染，另一部分則發(fā)展為慢性病毒攜帶者，主要與機體接觸的環(huán)境、個人免疫狀況、病毒數(shù)量和殺傷力、病毒基因型、感染機體的年齡和性別等因素有關(guān)[3]。單核苷酸多態(tài)性是指在基因水平上使DNA變異，改變其序列，該過程直接影響原基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而改變蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)。早期研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素(IL-8)在慢性HBV感染時表達會嚴(yán)重損害肝臟組織，某些特定位點的核苷酸也與基因的活性有關(guān)[4]。筆者利用DNA測序技術(shù)檢測102例慢性HBV感染者和101例急性自限HBV感染者IL-8基因多態(tài)性。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2017年2月在本院門診接受治療的HBV感染者203例，其中102例慢性HBV感染者為試驗組，101例急性自限HBV感染者作為對照組。兩組患者基本資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組患者基本資料比較

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)[5，6]納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者臨床診斷均符合2015年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》；②無合并HAV、HDV、HCV、HEV感染；③均為無血緣關(guān)系的漢族人群；④均未接種過乙肝疫苗；⑤均簽訂知情同意協(xié)議。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有心血管疾病、腎臟及內(nèi)分泌問題引起的肝臟功能異常；②患有肝血吸蟲病，合并其他肝炎病毒感染；③之前接種過乙肝疫苗。

1.3 標(biāo)本采集 采集患者外周靜脈血 2 管，1 管應(yīng)用 EDTA 抗凝，3 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，分離血細胞和血漿，于-20℃冰箱保存血細胞，用以提取 DNA；另1管凝血，于 3 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min分離血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒上步驟檢測標(biāo)本中血清中IL-8水平。

1.4 實驗方法 在血細胞中提取DNA，并鑒定DNA純度，若A260/A280≥1.8說明提取的DNA比較純凈，若該值小于1.6則說明之前提取的DNA純度不夠，還需再行抽取，本試驗提取的DNA均符合要求。加入相關(guān)引物后，對抽取的DNA進行IL-8-251A/T、IL-8-738T/A和IL-8-845T/C位點進行PCR擴增，并對酶切產(chǎn)物進行鑒定測序。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者IL-8基因啟動子區(qū)位點基因型及等位基因頻率分布 兩組患者IL-8基因251A/T位點包括AA、AT、TT 3種基因型，各基因型和等位基因頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。等位基因在慢性HBV感染輕度、中度、重度中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-8-738T/A和 IL-8-845T/C多態(tài)性位點PCR產(chǎn)物經(jīng)限制酶處理無任何變異，且試驗組和對照組無顯著差異，都只有1種TT基因型。

表2 兩組患者IL-8基因啟動子區(qū)251A/T位點基因型及等位基因頻率分布 [n(%)]

與對照組比較，*P<0.05

2.2 兩組患者血清中IL-8的表達情況 見表3。

表3 兩組患者血清中IL-8水平比較

與對照組比較，*P<0.05；與本組輕、重度比較，△P<0.05

2.3 IL-8-251A/T位點不同基因型慢性HBV感染者血清IL-8水平 見表4。

表4 IL-8-251A/T位點不同基因型慢性HBV感染者血清IL-8水平

與TT、AA基因型比較，*P<0.05；與TT基因型比較，△P<0.05

3 討論

HBV可通過母嬰、血和血液制品、破損的皮膚黏膜及性接觸傳播。慢性HBV感染者的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，與機體對病毒的免疫應(yīng)答有關(guān)，基因多態(tài)性影響基因產(chǎn)物，不同基因型轉(zhuǎn)錄及翻譯不同的蛋白質(zhì)影響機體對疾病的反應(yīng)[7～9]。慢性HBV感染分為4個時期：第1期為免疫耐受期，感染者處于耐受狀態(tài)，不能識別和清除HBV，但肝功能表現(xiàn)正常，HBV DNA為高水平復(fù)制期；第2期為免疫清除期，機體免疫系統(tǒng)增長，開始識別出病毒并進行清除；第3期為病毒抑制期，此期病毒并沒有被完全清除且處于弱勢；第4期為再活動期，HBV并不甘于在免疫抑制下生存，遇到機會便通過各種方式逃過機體免疫識別。

機體感染HBV后，細胞因子在宿主細胞中清除病毒，抗原刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，如HBsAb和HBcAb，這些抗體會殺滅HBV。病毒核衣殼進入肝細胞，打開環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)錄合成信使RNA[10～12]。非細胞病變和細胞因子介質(zhì)能抑制病毒復(fù)制而使細胞恢復(fù)正常功能。這些病毒復(fù)制水平極高，導(dǎo)致血清HBeAg和HBV DNA為陽性，肝臟并發(fā)炎癥，雖并不影響肝細胞損傷但會誘導(dǎo)其器官損害。慢性HBV特異性反應(yīng)較弱，尤其是CD4T細胞反應(yīng)和CTL反應(yīng)弱，不足以清除所有感染HBV，病毒持續(xù)侵害肝細胞。IL-8的介質(zhì)是導(dǎo)致炎癥的趨化因子，會在感染部位釋放氧化酶和溶酶體而破壞局部組織和細胞[13,14]。細胞中的中性粒再接觸機體異物是會發(fā)生呼吸爆炸反應(yīng)，釋放大量的活性氧化基，導(dǎo)致中性粒向炎癥部位浸潤，使炎癥效應(yīng)更大，組織損傷更嚴(yán)重。目前檢測限制性片段長度多樣性和單鏈構(gòu)象多態(tài)性，等位基因核苷酸特異性雜交，采用DNA測序和PCR指紋圖法等檢測技術(shù)測定。IL-8目前也備受關(guān)注，作為多態(tài)性細胞因子，其多態(tài)性與疾病之間的癥狀聯(lián)系密切相關(guān)。

研究結(jié)果顯示，IL-8基因啟動子區(qū)251A/T位點單核苷酸多態(tài)性與慢性HBV感染者發(fā)病存在相關(guān)性，但與疾病嚴(yán)重程度無明顯關(guān)系。A等位基因容易誘發(fā)慢性HBV感染，血清中IL-8指標(biāo)狀況與病情程度有關(guān)。IL-8-738T/A和IL-8-845T/C單核苷酸多態(tài)性與慢性HBV感染者是否發(fā)病沒有相關(guān)性。由于本次研究的IL-8基因多態(tài)性的分析實驗對象樣本較少，缺少更大的獨立樣本數(shù)據(jù)作為有力依靠，但本研究的結(jié)果提示IL-8單核苷酸多態(tài)性與慢性HBV感染結(jié)局的有關(guān)聯(lián)性。研究IL-8基因的多態(tài)性與疾病癥狀的關(guān)系，可從分子水平解釋發(fā)病機制，為疾病的預(yù)防和治療提供新途徑。