術(shù)中快速冰凍切片環(huán)保封片劑封片效果的探討

蔣麗娟 馬邦磊 儲誠卓

[摘要] 目的 探討術(shù)中快速冰凍切片制作中Mounting Medium環(huán)保封片劑的封片效果。 方法 分別于12杯5 mL中性樹膠中依次滴加0.1～1.2 mL（以0.1 mL/杯遞增）二甲苯，配制成不同濃度的封片液，對快速冰凍切片進行封固試驗，對比觀察不同濃度封片液間氣泡數(shù)量的變化情況，得出最佳二甲苯中性樹膠封片液濃度，再以最佳封片濃度的二甲苯中性樹膠封片液與環(huán)保封片劑效果進行對比，從而判斷后者的封片效果。試驗于2019年6月18日完成。 結(jié)果 （1）中性樹膠與二甲苯最佳的配比度為12.5：1（5 mL：0.4 mL），此時封片產(chǎn)生的氣泡量最少、效果最佳;（2）在封片時氣泡產(chǎn)生量的影響方面，環(huán)保封片劑與0.4 mL二甲苯中性樹膠封片液之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 Mounting Medium環(huán)保封片劑可以作為傳統(tǒng)二甲苯中性樹膠封片液的良好替代品，是一種值得推廣的術(shù)中快速冰凍切片環(huán)保封片劑。

[關(guān)鍵詞] 術(shù)中快速冰凍切片;Mounting Medium環(huán)保封片劑;中性樹膠;二甲苯

[中圖分類號] R338.6 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）31-0124-04

Discussion on sealing effect of environment friendly sealing agent for intraoperative fast frozen slice

JIANG Lijuan1 ? MA Banglei1 ? CHU Chengzhuo1 ? ZHANG Runjie1 ? WANG Kang2

1.Department of Pathology， Affiliated Womens Hospital of Nanjing Medical University（Nanjing Maternal and Child Health Hospital），Nanjing 210004，China; 2.Department of Pathology， Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210001，China

[Abstract] Objective To investigate the sealing effect of Mounting Medium environment friendly sealing agent in intraoperative fast frozen slice preparation. Methods There were 12 cups of 5 mL of neutral balsam， to which 0.1-1.2 mL （increased by 0.1 mL/cup） of xylene was added in order to prepare sealing liquids with different concentrations for the sealing experiment on fast frozen slices. The changes of the numbers of bubbles in the sealing liquids with different concentrations were observed and compared， based on which the optimal sealing liquid concentration of xylene neutral balsam was obtained and compared to the environment friendly sealing agent in order to determine the sealing effect of the latter. The experiment was completed on June 18， 2019. Results ①The optimal ratio of neutral gum to xylene was 12.5∶1 （5 mL∶0.4 mL）， which generated the least bubbles and best effect. ②In terms of bubble generation during sealing， the difference between the environment friendly sealing agent and the neutral balsam sealing liquid with 0.4 mL of xylene was not statistically different（P>0.05）. Conclusion Mounting Medium environmental friendly sealing agent can serve as a good substitute for traditional xylene neutral balsam sealing liquid and is worthy of promotion in intraoperative fast frozen slice preparation.

[Key words] Intraoperative fast frozen slice; Mounting Medium environment friendly sealing agent; Neutral balsam; Xylene

手術(shù)中快速冰凍檢查準確診斷的前提是優(yōu)良的制片。冰凍切片制作主要包括切片、固定、染色、封片等步驟，任一操作環(huán)節(jié)的調(diào)整都會對切片質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響[1]。作者在對2018年全年冰凍切片進行質(zhì)控時發(fā)現(xiàn)，不同時段的切片質(zhì)量主要受氣泡數(shù)量變化的影響較大，通過查閱資料分析比對，初步考慮氣泡的產(chǎn)生可能與中性樹膠封片液的稀釋度有關(guān)，過稀過稠均易產(chǎn)生氣泡[2]。二甲苯是中性樹膠的稀釋液，但二甲苯易揮發(fā)、毒性強，具有強烈的刺激氣味[3]，為避免環(huán)境污染，本科室近期采購了新型的Mounting Medium環(huán)保封片劑，相比中性樹膠封片液，環(huán)保封片劑不僅具有無色無味無污染的優(yōu)勢，而且不需探討最佳稀釋濃度就可直接使用，減少了技術(shù)操作步驟，一定程度上避免了部分人為因素的干擾，但在冰凍切片封固過程中對氣泡數(shù)量的影響方面，與中性樹膠封片液之間的差異有無統(tǒng)計學(xué)意義，能否作為后者的良好替代品，還需要進一步研究探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

賽默飛世爾（中國）有限公司生產(chǎn)的冰凍切片機;賽默飛世爾（中國）有限公司生產(chǎn)的蘇木素、伊紅染液各500 mL;賽默飛世爾（中國）有限公司生產(chǎn)的NEG-50 OTC膠1瓶;無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司生產(chǎn)的Mounting Medium環(huán)保封片劑50 mL;國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的中性樹膠100 g;上海久億化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純二甲苯1500 mL;上海久億化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的95%乙醇100 mL、冰醋酸10 mL;江蘇世泰實驗器材有限公司制造的病理級顯微鏡載玻片6盒（浮法玻璃、高清潔度、規(guī)格：25 mm×75 mm、厚度：1～1.2 mm）;江蘇世泰實驗器材有限公司制造的高品質(zhì)顯微鏡蓋玻片300片（超白玻璃、規(guī)格：24 mm×24 mm;厚度：0.13～0.16 mm）;一次性尿杯12個;10 mL一次性塑料滴管20支。

1.2 方法

1.2.1 固定液及封片液的配制 ?（1）乙醇-冰醋酸固定液配制：95%乙醇100 mL滴加3～5滴冰醋酸，充分攪勻，待用[4];（2）不同濃度中性樹膠封片液制備：將一次性尿杯擦拭干凈;分別編1～12號，每杯加5 mL中性樹膠。第一杯加入0.1 mL二甲苯，第2～12杯每杯依次增加0.1 mL二甲苯，至第12杯內(nèi)注入1.2 mL二甲苯。將配好的中性樹膠充分攪勻，待用[4]。

1.2.2 快速冰凍組織切片的制備 ?將送檢新鮮標本切割成2 cm×1.7 cm×0.2 cm組織塊，于冷凍臺上滴加少量OTC膠，迅速將組織塊粘附其上，于組織上滴加適量OTC膠，將冰凍切片機溫度調(diào)制-25℃加速冷凍[5]，待組織塊冷凍變硬后固定于切片臺上，先粗修待組織完整暴露后進行5 μm連續(xù)切片，將組織片粘附于載玻片上，立即置入乙醇-冰醋酸固定液中，1 min后取出[4，6]。

1.2.3 冰凍切片HE染色 ?（1）蒸餾水中1 min;（2）蘇木素染液染色5～10 min;（3）流水洗去蘇木素染液1 min;（4）1%鹽酸-乙醇分化液中放置1～3 s;（5）流水沖洗1～2 s;（6）在1%的氨水中返藍5～10 s;（7）流水沖洗2～4 min;（8）0.5%伊紅染液染色1～3 min;（9）蒸餾水洗1～2 s;（10）80%乙醇中放置1～2 s;（11）分別于第一、二缸95%乙醇中放置2～3 min;（12）分別于第一、二、三缸無水乙醇中放置3～5 min;（13）分別于第一、二、三缸二甲苯中放置3～5 min[4]。

1.2.4 冰凍組織切片的封固 ?由同一名技術(shù)熟練的病理技師采用同一種手工封片方法，分別從1～12杯中用每杯專用的滴管吸取適量封片液，滴加于組織切片上，最后加蓋蓋玻片，每種濃度的封片液分別封固20張切片。再用Mounting Medium環(huán)保封片劑封固20張切片。

1.3 結(jié)果判讀

由兩名中級以上病理醫(yī)師采用雙盲法觀察封固后切片中氣泡的數(shù)量，按照是否存在氣泡及氣泡的數(shù)量進行分組統(tǒng)計，當觀察結(jié)果有差異時以最高值為準。采用王燦等[2]的評判標準進行評估：（-）為無氣泡;（+）為少量氣泡，每片氣泡≤5個;（++）為中等量氣泡，5個<每片氣泡≤10個;（+++）為大量氣泡，每片氣泡>10個。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用四格表資料的χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度二甲苯中性樹膠封片液封片時氣泡產(chǎn)生率比較

研究發(fā)現(xiàn)1～3及7～11號封片液所封片氣泡數(shù)量多而明顯;4～6號封片液所封片氣泡量少，其中氣泡量最少的為4號（加入0.4 mL二甲苯）;12號封片液所封片氣泡量介于前二者之間（表1）。再對每組間氣泡產(chǎn)生率的差異進行統(tǒng)計學(xué)分析。12與9、11號之間氣泡產(chǎn)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.129，P=0.288）;12與2、3、10號之間氣泡產(chǎn)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.133，P=0.144）;12與7、8號之間氣泡產(chǎn)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.584，P=0.058）;12與1號之間氣泡產(chǎn)生率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.625，P=0.018）（表2）。4與5、6號之間氣泡產(chǎn)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.173，P=0.677）;4與12號之間氣泡產(chǎn)生率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.417，P=0.001）（表3）?？梢姡行詷淠z與二甲苯最佳的配比度為12.5：1（5 mL：0.4 mL），此時封片產(chǎn)生的氣泡量最少、效果最佳。

2.2 環(huán)保封片劑與0.4 mL二甲苯中性樹膠封片液封片時氣泡產(chǎn)生率比較

環(huán)保封片劑與0.4 mL二甲苯中性樹膠封片液之間氣泡產(chǎn)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.290，P=0.256）。見表4。

3 討論

手術(shù)中快速冰凍檢查是手術(shù)醫(yī)師在實施手術(shù)過程中向病理醫(yī)師發(fā)起的急會診，主要針對病變良惡性的快速判斷，快速冰凍結(jié)果往往決定著手術(shù)方案的選擇，優(yōu)良的制片是準確診斷的前提[7]，作者通過2018年全年本科室切片質(zhì)控，發(fā)現(xiàn)切片封固時產(chǎn)生的氣泡數(shù)量是影響冰凍切片質(zhì)量的重要因素之一[8]。作者發(fā)現(xiàn)，快速冰凍切片封固時，中性樹膠和二甲苯的配比濃度至關(guān)重要，否則易產(chǎn)生外溢或氣泡[9]，封片的中性樹膠濃度要適中，過稀易產(chǎn)生大氣泡，封片液外溢污染切片;過稠厚易出現(xiàn)厚薄不均，折光差并產(chǎn)生細小氣泡，這與文獻中的報道一致[2]，然而二甲苯易揮發(fā)，配制的二甲苯中性樹膠封片液很難維持在固定的配比，同時封片液濃度也受室溫變化的影響較大，因此工作中經(jīng)常需要頻繁更換;此外，二甲苯作為中性樹膠稀釋液有較強的刺激氣味和毒性，因此有必要采用一種不易揮發(fā)、性質(zhì)穩(wěn)定、無毒無害的環(huán)保封片劑作為傳統(tǒng)二甲苯中性樹膠封片液的替代品[10]，本文作者單位采購了新型Mounting Medium環(huán)保封片劑，理化性質(zhì)均符合替代品的要求，但在冰凍切片封固過程中對氣泡數(shù)量的影響方面，與中性樹膠封片液之間的差異有無統(tǒng)計學(xué)意義，能否作為后者的良好替代品，尚需實驗進一步證實。

首先，對冰凍切片封片時最佳中性樹膠濃度進行探討。表1中的數(shù)據(jù)主要分為三組，第一組為1～3、7～11號封片液，其間封片氣泡產(chǎn)生率較接近;第二組為4～6號封片液，其間封片氣泡產(chǎn)生率相接近;第三組為第12號封片液，封片氣泡產(chǎn)生率介于前兩組之間。因此，作者分別將第一組、第二組的封片氣泡產(chǎn)生率與第三組進行對比，通過一、三組間比較發(fā)現(xiàn)，在對切片氣泡量影響方面，12號與2、3、7～11號封片液間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與1號封片液間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即在5 mL中性樹膠中分別滴加入0.2、0.3、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL二甲苯進行稀釋后，對封片時氣泡產(chǎn)生量的影響是相同的，而加入0.1 mL二甲苯稀釋后的封片液則會較以上各組封片液產(chǎn)生更多氣泡;對比二、三組后發(fā)現(xiàn)，在對切片氣泡量影響方面，4號與5、6號封片液間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與12號封片液間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即在5 mL中性樹膠中分別滴加入0.4、0.5、0.6 mL二甲苯進行稀釋后，對封片時氣泡產(chǎn)生量的影響是相同的，并且0.4 mL組封片液封片的氣泡產(chǎn)生率、大氣泡產(chǎn)生率均最低，而加入1.2 mL二甲苯稀釋后的封片液則會較以上各組封片液產(chǎn)生更多氣泡。由此可見，快速冰凍切片封片中，中性樹膠與二甲苯最佳的配比度為12.5：1（5 mL：0.4 mL），此時封片產(chǎn)生的氣泡最少、效果最佳，極大的提高了切片觀察的清晰度，避免了因影響切片觀察而造成的診斷困難;當二者配比度高于50：1（5 mL：0.1 mL）時，封片時產(chǎn)生的氣泡量顯著增加，封片合格率最低，將會嚴重影響冰凍切片的質(zhì)量，導(dǎo)致病理醫(yī)師觀察困難，甚至無法診斷，應(yīng)當避免;而當二者配比度介于4～7∶1[5 mL：（0.7～1.2 mL）]或17～25：1[5 mL：（0.2～0.3）mL]間，封片時亦會產(chǎn)生較多氣泡，也應(yīng)加以避免。

其次，對比分析環(huán)保封片劑與最佳封片濃度中性樹膠封片液的封片氣泡產(chǎn)生率，從而評價前者的封片效果。上述試驗已證明，快速冰凍切片封片中，中性樹膠與二甲苯最佳的配比度為12.5：1（5 mL：0.4 mL），當用配比度為5 mL：0.4 mL的封片液封固冰凍切片時，封片氣泡產(chǎn)生率最低（15%），因此作者選用配比度為5 mL：0.4 mL的二甲苯中性樹膠封片液與環(huán)保封片劑進行封片氣泡產(chǎn)生率對比，發(fā)現(xiàn)在對切片氣泡量影響方面，環(huán)保封片劑與0.4 mL二甲苯中性樹膠封片液間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即環(huán)保封片劑與0.4 mL二甲苯中性樹膠封片液，對封片時氣泡產(chǎn)生量的影響是相同的。由此可見，采用環(huán)保封片劑進行快速冰凍切片封固，產(chǎn)生的氣泡量少，清晰度高，很大程度的提高了封片合格率，有助于病理醫(yī)師的觀察和診斷。

綜上所述，Mounting Medium環(huán)保封片劑可以作為傳統(tǒng)二甲苯中性樹膠封片液的良好替代品[11，12]，這樣既避免了由于二甲苯揮發(fā)而造成的傳統(tǒng)中性樹膠封片液的濃度穩(wěn)定性差的問題，也預(yù)防了二甲苯對工作環(huán)境的污染，保證了工作人員的安全;同時減少了技術(shù)操作步驟，簡化了操作流程，一定程度上避免了部分人為因素的干擾，是一種值得推廣的術(shù)中快速冰凍切片環(huán)保封片劑。

本文試驗數(shù)據(jù)建立于本單位特定的試驗環(huán)境之下，在不同的實驗室之間可能存在一定的差異，比如南、北方氣候不同，可能在數(shù)據(jù)方面會有一定偏差。此外，該研究僅探討了術(shù)中冰凍切片的封固問題，冰凍切片制作流程不同于常規(guī)石蠟切片，而且本研究只是針對同一患者同一部位組織進行，由于人體不同組織器官的冰凍切片制作也有一定差異[13-15]，因此，本研究結(jié)論是否同時適用于常規(guī)石蠟病理切片、細胞學(xué)涂片，是否同時適用于人體其它部位的組織，尚需進一步細化分層研究證實。

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（收稿日期：2019-07-09）