NK細胞體外培養(yǎng)及對HepG2細胞的殺傷活性研究*

韓光宇 周忠海 張 巍 任思坡 譚 昆

1 江蘇省徐州市醫(yī)學科學研究所 221006；2 解放軍第九七醫(yī)院；3 徐州市急救醫(yī)療中心

NK細胞又稱自然殺傷細胞，是一類CD3-TCR-的大顆粒淋巴細胞，是執(zhí)行非MHC限制性殺傷功能的主要細胞，也是體內(nèi)天然防御功能中的重要組分。NK細胞無須抗原刺激，可非特異直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細胞，在機體免疫監(jiān)視和早期抗感染和免疫過程中起重要作用[1]。NK細胞來源于骨髓造血干細胞，其發(fā)育成熟依賴于骨髓及胸腺微環(huán)境，占淋巴細胞總數(shù)的9%～25%[2]，本研究通過體外培養(yǎng)將單個核細胞培養(yǎng)為NK細胞并觀察對HepG2細胞的殺傷活性。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 HepG2細胞株(中國科學院上海細胞庫)；NK細胞培養(yǎng)基(CellGroRGMP SCGM)；IL-2(沈陽三生制藥)，胎牛血清(GIBCO)；異硫氰酸熒光素(FITC-CD3)、別藻青蛋白(APC-CD56)、藻紅蛋白(PE -CD107a)、穿孔素、顆粒酶B和破膜劑(eBioscience，美國)。淋巴細胞分離液(天津灝洋)，流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)。大容量低速水平離心機(美國Beckman-Clouter)，倒置顯微鏡(浙江永新)，酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司)等。無血清培養(yǎng)基(日本TAKARA GT551 H3)

1.2 實驗樣本 采集外周血約20ml，肝素抗凝。

1.3 實驗方法

1.3.1 NK細胞培養(yǎng)：將抗凝外周血用生理鹽水1∶1稀釋，將稀釋液小心平鋪到淋巴細胞分離液上層。2 000r/min離心20min，吸取白膜層，生理鹽水洗滌3次，去上清，將細胞用NK培養(yǎng)基重懸調(diào)整細胞密度1×106/ml，補加IL-2 200U/ml接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞形態(tài)及生長情況，及時換液和補充培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)12d的貼壁細胞進行細胞表面標志物檢測和相關(guān)實驗。

1.3.2 HepG2細胞株培養(yǎng)：HepG2細胞株置于GT551 H3培養(yǎng)基中， 5%CO2、37℃條件下擴增培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的貼壁細胞進行相關(guān)試驗。

1.3.3 NK細胞表型檢測：以FITC-CD3、APC-CD56與培養(yǎng)第12天的NK細胞及未培養(yǎng)的細胞(細胞密度5×106/ml)避光孵育15min，用流式細胞術(shù)進行表型檢測。

1.3.4 NK細胞分泌細胞毒顆粒水平檢測：收集培養(yǎng)第12天的NK細胞加入FITC-CD3、APC-CD56、PE-CD107a，破膜劑、穿孔素、顆粒酶B，用流式細胞術(shù)檢測其表達水平。

1.3.5 LDH釋放法測定細胞殺傷活性：取對數(shù)生長期的HepG2細胞用含10%FCS的RPMI1640調(diào)整細胞密度為2×105/ml，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加100μl靶細胞，其中靶細胞自然釋放孔不加效應細胞，只加100μl培養(yǎng)液；效應細胞孔不加靶細胞只加100μl培養(yǎng)液；最大釋放孔加100μl 1%NP40；實驗孔分別按5∶1、10∶1、20∶1的效靶比加入效應細胞NK細胞100μl，每種均做3個復孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)4～6h，加入顯色反應體系，490nm波長(參考波長650nm)測定其吸光度A值，按照LDH釋放法計算殺傷活性：殺傷活性(%)=[(實驗組A值-總自然釋放A值)/(最大釋放組A值-總自然釋放A值)]×100%。

2 結(jié)果

2.1 NK細胞形態(tài)學觀察和表型檢測 培養(yǎng)第0天細胞體積小，鏡下多散在，圓形透亮，在NK培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h即可見貼壁生長，2～3d后細胞聚集，成簇狀克隆樣生長；體積變大呈多形性，異質(zhì)性明顯。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，第0天(培養(yǎng)前)的PBMC 細胞CD3-CD56+陽性率為(14.2±5.1)%，而培養(yǎng)12d的NK細胞CD3-CD56+陽性率(73.6±11.3)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)

2.2 NK細胞分泌細胞毒顆粒水平檢測 經(jīng)流式細胞儀檢測，其穿孔素、顆粒酶B、CD107a的表達水平分別為(75.5±10.9)%、(62.2±8.9)%、(63.9±10.5)%。

2.3 NK細胞毒活性測定 效靶比為5∶1、10∶1、20∶1時，NK細胞對HepG2對殺傷率分別為(23.1±2.4)%、(35.6±3.1)%、(58.3±5.2)% ，隨效靶比增加，殺傷活性增強(P<0.05)。

3 討論

NK細胞來源于骨髓造血干細胞，其發(fā)育成熟依賴于骨髓及胸腺微環(huán)境，其表面標志主要有CD3、CD56、CD16等。通常情況下，體內(nèi)的NK細胞多處于休眠狀態(tài)，信號因子激活后，NK細胞無須抗原刺激和MHC的限制可非特異直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細胞，在機體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起重要作用，構(gòu)成了機體第一道免疫殺傷防線[3]。研究證實腫瘤患者體內(nèi)NK細胞數(shù)量減少、功能異常，不能正常發(fā)揮作用是導致腫瘤免疫逃逸的重要機制[4]。

NK細胞具有細胞介導的細胞毒作用，無須抗原刺激可直接殺傷靶細胞，對腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移擴散具有抑制作用，可清除術(shù)后微小殘留病灶、降低復發(fā)，被認為是腫瘤免疫治療的重要免疫細胞[5]。因此，如何獲得高純度、大劑量的NK 細胞成為NK 細胞應用最為關(guān)鍵的問題之一。不同的擴增方案和不同的抗凝劑會對NK細胞的增殖產(chǎn)生影響。IL-2具有激活NK細胞，促進NK細胞分化和產(chǎn)生細胞因子的能力，因此體外培養(yǎng)時在NK培養(yǎng)基中加入IL-2可促進NK細胞增殖[6-7]。

活化的 NK細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫以及直接殺傷靶細胞的作用，成為近年來免疫治療研究的熱點。NK細胞受觸發(fā)信號激活后，首先通過脫顆粒過程釋放穿孔素和顆粒酶B到達靶細胞，穿孔素通過在靶細胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道，介導顆粒酶B進入靶細胞，顆粒酶B是NK細胞顆粒中重要的絲氨酸蛋白酶，它通過激活Caspase級聯(lián)反應，引起靶細胞遺傳物質(zhì)DNA的斷裂，導致靶細胞凋亡，CD107a可能與NK細胞活化及脫顆粒有關(guān)[8]。此外，NK細胞還分泌多種細胞因子，如TNF-α和IFN-γ以及趨化因子，參與刺激和激活適應性免疫反應。有研究認為NK細胞活化后，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)和Fas配體(FasL)在NK細胞表面上調(diào)，也可以通過刺激靶細胞表面表達的死亡受體來殺死靶細胞，并且誘導靶細胞凋亡[9]。本研究結(jié)果顯示培養(yǎng)的NK細胞對HepG2細胞有明顯的殺傷活性，可能與上述殺傷機制有關(guān)，有待進一步研究。

《2016年臨床癌癥進展：ASCO 癌癥研究進展年報》肯定了免疫治療在癌癥治療領(lǐng)域的革命性進展[10]。免疫治療如細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)回輸治療能提高肝癌患者的無復發(fā)生存率、總生存率，并顯示了良好的安全性[11]。NK細胞作為腫瘤免疫治療重要的效應細胞，臨床研究已經(jīng)證實了NK細胞在包括肝癌的實體瘤過繼免疫治療中的療效[12]。通過本實驗，NK細胞可在體外大量培養(yǎng)，對肝癌細胞的殺傷活性隨效靶比的增加而增強，為臨床研究和應用奠定了實驗基礎(chǔ)。