何首烏組培快繁技術(shù)研究

倪榮興 陳曉欣 郭梓杰

摘要 ? ?為建立道地種源德慶何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）組培快速繁殖體系，為生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種苗，本文以何首烏的帶腋芽莖段為外植體，通過(guò)單因素變量法探究何首烏叢生芽、生根和煉苗的適宜條件。結(jié)果表明，誘導(dǎo)何首烏外植體叢生芽的適宜配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;誘導(dǎo)何首烏生根的適宜配方為1/2 MS+0.1 mg/L NAA，生根率達(dá)100%;建立了道地種源德慶何首烏組培快速繁殖體系。

關(guān)鍵詞 ? ?何首烏;快速繁殖;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) ? ?S567.23+9 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2019）21-0075-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract ? ?In order to establish a rapid propagation system of Polygonum multiflorum Thunb.，provide the high-quality seedlings for production，the stems of the roots of Polygonum multiflorum Thunb. were used as explants，and the single-factor variable method was used to explore the growth of suitable conditions for buds，rooting and seedling adaptation. The results showed that the suitable formula for inducing shoots of Polygonum multiflorum Thunb. explants was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，the suitable formula for inducing rooting of Polygonum multiflorum Thunb. was 1/2 MS+0.1 mg/L NAA，the rooting rate was 100%.

Key words ? ?Polygonum multiflorum Thunb.;rapid propagation;tissue culture

中藥何首烏來(lái)源于蓼科植物何首烏（Polygonum multifl-orum Thunb.）的干燥塊根，主要成分有二苯乙烯苷、蒽醌類等[1]。

有研究表明，何首烏具有抗衰老[2]、抗抑郁[3]、抗癌[4]等作用。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，何首烏的用途由傳統(tǒng)醫(yī)藥行業(yè)拓展到保健、化工等行業(yè)，具有廣闊的開發(fā)利用前景[5]。為應(yīng)對(duì)何首烏資源日益減少的現(xiàn)狀，亟需進(jìn)行何首烏人工繁殖[6]。本文以何首烏道地產(chǎn)區(qū)德慶種源何首烏為研究對(duì)象，建立何首烏快速繁殖體系?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料采自廣東省德慶縣，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院嚴(yán)寒靜教授鑒定為德慶種源何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）。

1.2 ? ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ? ?外植體消毒滅菌。采集何首烏的帶腋芽莖段作為外植體，用自來(lái)水沖洗20 min后，用75%乙醇浸泡30 s，再用無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡9、10、11、12 min（分別記為處理A1、A2、A3、A4），再用無(wú)菌水沖洗5次，把接觸消毒液兩端的損傷組織剪去，剪成長(zhǎng)大約1.5 cm小段，每個(gè)小段帶1個(gè)腋芽。把消毒后的外植體接種于MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基。根據(jù)0.1%氯化汞溶液處理時(shí)間不同，每組接種30瓶，每瓶接種3個(gè)外植體。在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環(huán)境下培養(yǎng)10 d。之后，統(tǒng)計(jì)外植體的染菌率和存活率，篩選出外植體消毒的適宜時(shí)間。計(jì)算公式如下：

染菌率（%）=（染菌株數(shù)/接種總株數(shù)）×100;

存活率（%）=（叢生芽成活株數(shù)/接種總株數(shù)）×100。

1.2.2 ? ?莖尖叢生芽誘導(dǎo)。一是不同濃度6-BA對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)定NAA濃度為0.1 mg/L，設(shè)定6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L（分別記為處理B1、B2、B3、B4）。每組接種30瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環(huán)境下培養(yǎng)30 d。二是不同濃度NAA對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)定6-BA濃度為篩選出的適宜濃度，設(shè)定NAA濃度分別為0.10、0.20、0.30 mg/L（分別記為處理B5、B6、B7），每組接種30瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環(huán)境下培養(yǎng)30 d。

1.2.3 ? ?不同6-BA和NAA組合對(duì)芽增殖的影響。采用單因素變量法，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)定NAA濃度為0.1 mg/L，設(shè)定6-BA濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L（分別記為處理C1、C2、C3、C4）。每組接種30瓶，每瓶接種3個(gè)帶1片葉子的叢生芽莖段，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環(huán)境下培養(yǎng)30 d。30 d后，統(tǒng)計(jì)外植體的增殖系數(shù)，篩選出誘導(dǎo)外植體叢生芽的最佳6-BA濃度。計(jì)算公式如下：

增殖系數(shù)=芽增殖數(shù)/接種總芽數(shù)

1.2.4 ? ?生根培養(yǎng)。當(dāng)何首烏叢生芽長(zhǎng)到6 cm左右，轉(zhuǎn)移至含有0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg/L NAA（分別記為處理D1、D2、D3、D4、D5、D6）的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，每組接種20瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環(huán)境下培養(yǎng)15 d。計(jì)算公式如下：

生根率（%）=（生根株數(shù)/接種總株數(shù)）×100

1.2.5 ? ?煉苗移栽。當(dāng)生根后的何首烏組培苗長(zhǎng)到6 cm左右，打開瓶蓋在蔭棚中適應(yīng)3 d、開蓋2～3 d后，再水培5 d，然后移栽到不同培養(yǎng)基質(zhì)中。移栽基質(zhì)分為營(yíng)養(yǎng)土、河沙以及營(yíng)養(yǎng)土+河沙（1∶1）3個(gè)處理（分別記為處理E1、E2、E3），每組15株，培養(yǎng)20 d，比較成活率和生長(zhǎng)情況。計(jì)算公式如下：

成活率（%）=（煉苗成活株數(shù)/煉苗總株數(shù)）×100

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?不同消毒滅菌時(shí)間對(duì)外植體染菌率的影響

為了降低染菌率，需要對(duì)何首烏外植體進(jìn)行消毒。由表1可知，使用75%乙醇消毒30 s，再用0.1%氯化汞溶液處理11 min，可以使何首烏的染菌率降低，存活率相對(duì)較高，達(dá)到較理想的滅菌效果。

2.2 ? ?不同6-BA和NAA組合對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響

將何首烏外植體接種在含不同濃度外源激素組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～30 d形成叢芽。由表2可知，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)叢生芽最佳的6-BA濃度為2.0 mg/L。當(dāng)6-BA為2.0 mg/L、NAA為0.2 mg/L時(shí)，何首烏的增殖系數(shù)最高，達(dá)到9.94。

2.3 ? ?不同6-BA和NAA組合對(duì)芽增殖的影響

把組培苗小段接種于培養(yǎng)基7 d左右，可以看到何首烏開始抽芽，并且底部切口處膨大長(zhǎng)出愈傷組織，葉子變綠，莖段變得粗壯，大約40 d形成叢芽。由此可見，芽增殖過(guò)程具有壯苗作用。由表3可知，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L、6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，何首烏的增殖系數(shù)最高，達(dá)到6.38，小于誘導(dǎo)叢生芽的增殖系數(shù)。

2.4 ? ?不同濃度NAA對(duì)何首烏組培生根的影響

把何首烏組培苗帶1個(gè)側(cè)芽的莖段接種于含不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基上，觀察并記錄何首烏的生根狀況，統(tǒng)計(jì)其生根率。由表4可知，含有NAA的培養(yǎng)基較不含NAA的培養(yǎng)基生根率高，可見NAA具有促進(jìn)誘導(dǎo)生根的作用。低濃度的NAA對(duì)誘導(dǎo)何首烏生根作用較好。隨著NAA濃度的增長(zhǎng)，大部分生根率下降。當(dāng)NAA的濃度為0.1 mg/L時(shí)，何首烏的生根率最高，達(dá)到76.67%。

2.5 ? ?不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)煉苗移栽的影響

把何首烏組培苗移栽到室外的過(guò)程中，環(huán)境的溫度、適度、空氣、光照強(qiáng)度等都發(fā)生了較大的變化。為了增加成活率，應(yīng)該讓何首烏有一個(gè)適應(yīng)的過(guò)程。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在蔭棚中適應(yīng)3 d、開蓋2～3 d后，水培5 d再移栽，可使何首烏的成活率達(dá)到100%。本試驗(yàn)沒有具體探討適應(yīng)、開蓋、水培時(shí)間對(duì)成活率的影響，主要探究了營(yíng)養(yǎng)土、河沙以及營(yíng)養(yǎng)土+河沙（按1∶1比例混合）3個(gè)處理組對(duì)何首烏移栽后生長(zhǎng)狀況的影響。

把何首烏組培苗移栽后，可以觀察到有河沙培養(yǎng)的植株由于缺乏營(yíng)養(yǎng)，葉子變黃、長(zhǎng)勢(shì)緩慢、平均增加葉片數(shù)少。而處理E1、E3的何首烏生長(zhǎng)逐漸健壯，葉子逐漸長(zhǎng)大、變硬，綠色漸深，根須增多并且變長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)土富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為何首烏生長(zhǎng)提供了適合的營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)了生長(zhǎng)。由表5可知，使用營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)何首烏時(shí)，平均增加葉數(shù)最多，為8.2片。

3 ? ?結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)何首烏叢生芽最好，與陳 ?菊等[7]、姚 ?焱等[8]的結(jié)果有所差異。不同來(lái)源的何首烏材料，其組織培養(yǎng)結(jié)果有差異，可能與種源不同或個(gè)體差異有關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，何首烏組培苗的煉苗成活率為90%左右。本試驗(yàn)結(jié)果成活率較高的原因可能是與種源有關(guān)，也可能與組培技術(shù)有關(guān)。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，河沙的植株生長(zhǎng)狀況較差，這是由于何首烏在生長(zhǎng)過(guò)程中需要吸收一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，而河沙缺乏植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。雖然使用營(yíng)養(yǎng)土的增殖系數(shù)較使用營(yíng)養(yǎng)土+河沙（按1∶1比例混合）處理的平均增加葉片數(shù)多1.6片，但是它們的生長(zhǎng)情況都較好。如果營(yíng)養(yǎng)土與河沙混合的比例合適，不僅能使何首烏達(dá)到較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，而且能夠降低成本。

把何首烏帶腋芽莖段作為外植體，最佳的消毒滅菌條件為75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞溶液浸泡11 min;誘導(dǎo)何首烏外植體叢生芽時(shí)，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L?NAA培養(yǎng)基較好，接種30 d后芽的增殖系數(shù)可達(dá)9.94;誘導(dǎo)何首烏組培苗芽增殖時(shí)，以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基較好;誘導(dǎo)何首烏組培苗生根時(shí)，以1/2 MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基較好，接種15 d后何首烏組培苗的生根率可以達(dá)77.73%，約20 d可達(dá)100%;煉苗移栽時(shí)，在蔭棚中適應(yīng)3 d、開蓋3 d后，水培5 d再移栽，可使何首烏組培苗成活率達(dá)到100%;移栽培育的最佳基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土，植株生長(zhǎng)情況更好。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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