龍眼HD-Zip基因家族生物信息及表達分析

張春渝 徐小萍 陳曉慧 申序 林玉玲 賴鐘雄

摘 ?要??為了解龍眼HD-Zip基因家族的功能，本研究基于龍眼基因組與轉錄組數據庫，對提取的19個龍眼HD-Zip家族成員的啟動子、可變剪接以及受到調控的miRNA種類進行分析;并采用實時熒光定量PCR技術，分析了在ABA處理下龍眼胚性愈傷組織（embryonic callus，EC）中HD-Zip部分成員的表達模式，以及HD-Zip部分成員在不同體胚階段的表達模式。結果表明：龍眼HD-Zip家族除含有TATA-box和CAAT-box以外還含有大量的光響應元件、激素響應元件以及脅迫響應元件，暗示龍眼HD-Zip家族成員可能參與光反應、激素響應以及非生物脅迫的過程;龍眼HD-Zip在不同組織部位與不同體胚階段的可變剪接方式主要以內含子保留為主;龍眼HD-Zip基因家族成員主要受到miRNA166a的調控;在外源激素ABA處理下龍眼EC中HD-Zip家族部分成員的表達模式以及部分成員在不同體胚階段的表達模式都呈現多樣化，推測龍眼HD-Zip參與龍眼不同體胚發(fā)育的調控，并且可能通過調節(jié)內源ABA的濃度進而影響胚性愈傷組織的生長發(fā)育以及形態(tài)的建成。

關鍵詞 ?龍眼;HD-Zip基因;體胚;表達模式中圖分類號??S667.2??????文獻標識碼??A

Biological Information and Expression Analysis of HD-ZipGene Family in Dimocarpus longan?Lour.

ZHANG Chunyu， XU Xiaoping，?CHEN Xiaohui，?SHEN Xu，?LIN Yuling， LAI Zhongxiong^*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?In order to understand the function of the longanHD-Zipgene family， this study was based on the longan genome and transcriptome database， and analyzed the promoters， alternative splicing and regulated miRNA species of 19 longanHD-Zipfamily members， and the expression pattern ofHD-Zipmembers in longan embryogenic callus under ABA treatment and the expression patterns of some members at different somatic stages was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. The longanHD-Zipfamily contained a large number of photoresponsive elements， hormone response elements and stress response elements in addition to TATA-box and CAAT-box， suggesting that longan?HD-Zipfamily members may be involved in photoreactivity， hormone response and non-biological stress. The alternative splicing mode of longanHD-Zipin different tissue parts and different somatic embryo stages was mainly intron retention. The longanHD-Zipgene family members were mainly regulated by miRNA166a. The expression patterns of some members of theHD-Zip family in the longan EC stage under the treatment of exogenous hormone ABA?and the expression patterns of some members in different somatic embryo stages were diverse. It is speculated that longanHD-Zipparticipates in the regulation of different somatic embryo development in longan， and may affect the growth and development of embryogenic callus and the formation of morphology by regulating the concentration of endogenous ABA.

Keywords ?Dimocarpus longan Lour.;HD-Zipgene;?somatic embryo;?expression mode

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.004

HD-Zip（同源異型-亮氨酸拉鏈）蛋白是植物中特有的一類轉錄因子，屬于同源異型盒（homeobox，HB）蛋白家族。它包含有一個高度保守的同源異型結構域（HD）和一個亮氨酸拉鏈（LZ）結構域。HD-Zip蛋白可以根據結合的特異性DNA序列、基因結構、包含的其他基序以及功能等4個方面，分成4個不同的亞家族^[1-2]。近年來，HD-Zip已經在多種植物中有所報道，如大豆^[3]、桃^[4]、番茄^[5]等。HD-Zip基因家族在植物的生長發(fā)育中，發(fā)揮著多樣的功能，HD-ZipⅠ通常參與非生物的應激反應、脫落酸合成的有關過程;HD-ZipⅡ有參與調節(jié)生長素、誘導避蔭反應的功能;HD-ZipⅢ通常參與調控頂端分生組織;HD-ZipⅣ在花青素的積累、根系發(fā)育中起著重要的作用^{[2， 6-10]}。同時，HD-Zip在胚胎發(fā)育的過程中，也起到了重要作用。據2017年的報道稱，HD-Zip基因的4個亞家族中，均有成員參與了胚胎的發(fā)育^[11]。在HD-ZipⅠ中發(fā)現其成員的單個突變體不會引起任何胚胎發(fā)育的缺陷，但是這些突變體和胚胎發(fā)育中存在的激素卻有著一定的關系^[12];在紫花苜蓿中發(fā)現，其愈傷組織經過噻唑隆處理后胚性能力受到抑制，可能是通過調控MSHB1（HD-ZipⅡ）介導的^[13];在落葉松中發(fā)現HD-ZipⅢ的4個成員參與了體細胞胚胎的發(fā)育^[14];玉米HD-ZipⅣ家族成員能夠在胚胎發(fā)育期間在定義表皮不同區(qū)域中起作用^[15]。可見HD-Zip各亞家族成員都在胚胎發(fā)育中起著各自的作用。

龍眼（Dimocarpus longanLour.）屬于無患子科龍眼屬，是一種重要的熱帶、亞熱帶木本果樹，其胚胎發(fā)育與龍眼的生長情況、果實產量以及果實品質息息相關。但是由于龍眼童期長、遺傳上高度雜合^[16]，致使早期胚胎合子胚的采樣和觀察都比較困難，而利用本實驗室構建的龍眼體胚發(fā)生體系可以克服這些困難，通過研究龍眼體胚的發(fā)生體系進而分析龍眼的胚胎發(fā)育情況，有助于更好地了解龍眼的胚胎發(fā)育機制。當前，龍眼的胚胎發(fā)育是一個研究的熱點，近年來多有報道^[17-18]。目前雖有關龍眼HD-Zip家族的全基因組鑒定^[19]，但其在龍眼胚胎發(fā)育中的作用卻尚未見深入分析。因此有必要對龍眼HD-Zip家族的功能進行研究，進一步了解HD-Zip在龍眼胚胎發(fā)育中的重要作用。

可變剪接（alternative splicing，AS）方式常見的有5種類型，包含外顯子跳躍、互斥外顯子、3′端可變剪接、5′端可變剪接以及內含子保留^[20]。其中內含子保留是植物中最常見的可變剪接方式^[21]。據報道，AS可能參與植物中重要的功能，比如應激反應，并且可能影響植物的馴化以及性狀選擇^[22]。MicroRNAs（miRNAs）是一類內源性非編碼小RNA，調節(jié)植物和動物的基因表達，參與多種生物學過程，從器官分化到生物和非生物應激反應^[23]。其在HD-Zip家族中的研究也取得了一定的進展，如在白楊中，PtaHB1的表達量與Pta-miR166的水平呈現負相關^[24];在白花中，miRNA166與miR319在冷脅迫下于幼苗中上調表達，而它們的靶基因HD-ZipⅢ與GAMyb-like均呈現下調表達^[25]，脫落酸（ABA）是一種重要的植物激素，在擬南芥HD-Zip家族的研究中發(fā)現，通過ABA誘導的ATHB12負調節(jié)花序莖中赤霉素（GA20）氧化酶基因的表達^[26]。同時，值得關注的是，AS、miRNA、ABA都在胚胎發(fā)育過程起到了重要的作用：近期的研究發(fā)現，在擬南芥中，AtBUD13基因通過影響pre-mRNA剪接，在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮著關鍵的作用^[27];miRNA在擬南芥的體細胞發(fā)生過程強烈表達^[28];ABA在郁金香的魚雷形胚胎成熟和成熟體細胞胚的轉化過程中起著重要作用^[29]。本文通過對龍眼HD-Zip基因家族的啟動子順式作用元件、可變剪接事件、miRNA的預測，采用實時熒光定量PCR技術，對在外源激素ABA處理下龍眼HD-Zip家族部分成員在胚性愈傷組織中的表達模式，以及部分成員在不同體胚階段的表達模式進行分析，進而研究龍眼HD-Zip潛在的生物學功能，以期為研究HD-Zip在龍眼體胚發(fā)育機制中的作用提供參考。

2.1.1 ?龍眼HD-Zip光響應功能元件分析??在龍眼HD-Zip基因家族啟動子順式作用元件中，光響應功能元件的數目最多。每個基因家族成員都含有光響應功能元件，但包含的數量不盡相同，個數介于2～15。具有光響應功能的順式作用元件的種類豐富，包含ACE、I-Box、Box4、G-Box、G-box等一系列順式響應元件，共含22種（圖3）。在22種光響應順式作用元件中，Box4與G-box出現的頻率最高，二者都存在于15個成員中，但是各自存在的成員并不是完全相同的，其中既存有Box4又存有G-box順式作用元件的成員有12個。特別的是，在這些光響應順式作用元件中，有些成員存在自身特有的光響應順式元件，其中3-AF1 binding site為DLHB4-6特有的光響應順式元件;CAG-motif為DLHB1-1特有的光響應順式元件;AT1-motif為DLHB4-9特有的光響應順式元件;ATCT-motif為DLHB1-3特有的光響應順式元件;GA-motif為DLHB4-8特有的光響應順式元件?？梢?，龍眼HD-Zip成員包含的具有光響應功能的順式元件雖在種類上存在一定的相似性，但

同時又有一定差異，猜測龍眼HD-Zip基因家族成員對光的響應程度有所不同。

2.1.2 ?龍眼HD-Zip激素響應功能元件分析??在龍眼HD-Zip基因家族中包含5種類型的激素響應元件。具體包括脫落酸響應元件（ARE），赤霉素響應元件（P-box、GARE-motif、TATC-box），茉莉酸甲酯響應元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、生長素響應元件（AuxRR-core、TGA-element）

以及水楊酸響應元件（TCA-element）（圖4）。首先，在這5種類型的響應元件中，茉莉酸甲酯響應元件的數目最多，在所有激素功能響應元件中占有44個，脫落酸的數量次之含有43個。這暗示脫落酸和茉莉酸在龍眼的生長中起重要的作用;其次，這5種類型的響應元件在龍眼HD-Zip成員中的分布并不完全相同，其中DLHB2-1與DLHB4-9中包含5種激素響應元件;DLHB1-2、DLHB4-5、DLHB3-3、DLHB4-2包含4種激素響應元件，DLHB4-5對應的激素功能元件是脫落酸、水楊酸、生長素、茉莉酸甲酯響應元件，DLHB4-2與DLHB3-3對應的是脫落酸、赤霉素、生長素、茉莉酸甲酯響應元件，DLHB1-2對應的是脫落酸、赤霉素、生長素、水楊酸響應元件;僅有DLHB3-2，Dlo-026005.1只包含了一種激素功能響應元件，分別為茉莉酸甲酯響應元件與脫落酸響應元件;其余的家族成員都包含了2～3種激素響應元件。在這些響應元件中生長素響應元件的數量雖僅含有8個，但卻涉及4個亞家族的成員（DLHB1-2，DLHB2-1，DLHB3-3，DLHB4-1，DLHB4-2，DLHB4-5，DLHB4-9），這種情況提示了各個亞家族的成員在龍眼生長發(fā)育中既具有分工，又可能存在功能上的互補。由此可見龍眼HD-Zip基因家族成員參與了龍眼生長的激素響應調控。

2.2龍眼HD-Zip可變剪接分析

2.2.1 ?龍眼HD-Zip在不同組織部位的可變剪接分析??為進一步了解龍眼HD-Zip基因家族成員在不同組織部位中的可變剪接的發(fā)生狀況。將龍眼不同組織部位（花、花蕾、葉、果皮、果肉、

根、種子、莖、幼果）的可變剪接情況做了統(tǒng)計，結果見圖5。首先，從圖中可以發(fā)現，在每一個組織器官中，內含子保留的可變剪接方式的發(fā)生次數都高于其余3種（外顯子跳躍、3′端可變剪接、5′端可變剪接）可變剪接方式，可見內含子保留是龍眼HD-Zip基因家族成員在不同組織器官中的主要可變剪接方式;其次，其余3種可變剪接方式在不同組織部位的發(fā)生次數較為相近，其中在大部分的組織部位中外顯子跳躍的發(fā)生次數都是最少的;再者，并不是每一個組織部位都包含4種可變剪接方式，其中，在花和幼果中均存在3種可變剪接方式，前者是外顯子跳躍、3′端可變剪接、內含子保留，后者是3′端可變剪接、5′端可變剪接、內含子保留;在種子中只存在2種可變剪接方式（內含子保留、3′端可變剪接）。總的來說，龍眼HD-Zip基因家族成員在不同組織器官中，可變剪接方式不一，但主要以內含子保留方式為主。

2.2.2 ?龍眼HD-Zip在非胚性與胚性培養(yǎng)物中的可變剪接分析??在龍眼非胚性與胚性培養(yǎng)物中進行了龍眼HD-Zip的可變剪接情況預測，共檢測出了160次可變剪接事件（圖6）。結果表明，龍眼HD-Zip基因家族成員在不同體胚階段的可變剪接方式與不同組織器官的可變剪接情況不同。首先，內含子保留剪接方式并不是在每一個階段都存在的，在NEC、EC、ICpEC中內含子保留是主要的可變剪接方式，但在GE中卻不存在這種剪接方式;其次，內含子保留方式只在ICpEC中顯著高于其他3種可變剪接方式，再者，從圖6中可以發(fā)現，在龍眼早期胚胎EC到GE階段，內含子保留發(fā)生的次數呈現先下降再上升最后再下降的趨勢且在ICpEC階段達到了頂峰，暗示可變剪接在龍眼胚胎從EC到ICpEC的轉變階段中起到了重要的作用;5′端可變剪接的可變剪接發(fā)生次數呈現出了先減少后增多的現象，但變化趨勢不是很明顯;外顯子跳躍以及與3′端可變剪接發(fā)生的次數呈現上升的趨勢，但變化趨勢同樣不明顯?？傮w來說，在不同體胚中，龍眼HD-Zip基因家族成員發(fā)生內含子保留的次數高于其他可變剪接發(fā)生次數，故龍眼HD-Zip基因家族成員在不同體胚階段的可變剪接方式，主要還是以內含子保留為主。

2.3龍眼HD-Zip家族基因miRNA預測分析

采用在線軟件psRNAtarget對龍眼HD-Zip基因家族的成員進行miRNA分析。第1次搜索將期望值設置為E=3.5，預測龍眼miRNA數據庫中靶向調控HD-Zip家族成員的miRNA種類。共搜索出了5條結果，結果表明：19個龍眼HD-Zip家族成員有5個成員受到了miRNA的調控。其中龍眼HD-Zip家族主要受到miR166a的調控，并且調控的成員都是第Ⅲ亞家族的成員（DLHB3-1、DLHB3-2、DLHB3-3、DLHB3-4）。猜測miR166a通過調控HD-ZipⅢ，從而在植物的生長中起到重要的作用;此外該家族還受到了miR2118e的靶向調控（DLHB4-3）。

為了預測各亞家族的miRNA種類，第2次搜索將期望值設置為E=4.0。當E=4.0時，我們發(fā)現龍眼HD-Zip家族主要還受到miR444b的調控，且調控的家族成員都是第Ⅳ亞家族的成員（DLHB4-5、DLHB4-6）;提示miR444b可能在該亞家族中有著重要的調控作用;同時我們發(fā)現，DLHB2-1受到了miR417的靶向調控;DLHB1-3受到了miR437c的靶向調控（表2）。在E=4.0的條件下，各亞家族成員雖都受到miRNA的調控，但不難發(fā)現龍眼HD-Zip第Ⅲ、Ⅳ亞家族的成員受到miRNA的調控較多。總的來說，不同亞家族受到調控的miRNA種類不同，但同一亞家族成員受到的調控雖較為一致但也有差異，可能是HD-Zip家族的各亞家族成員之間的結構與功能特異性所致。

2.4在ABA處理下龍眼EC中HD-Zip的表達模式分析

由于在龍眼HD-Zip成員中廣泛存在ABA響應元件，因此在龍眼HD-Zip各亞家族成員中隨機選取了1條基因（DLHB1-3、DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-6）通過qPCR分析它們在ABA處理下龍眼EC中的表達模式。由圖7可知，首先，在不同濃度的ABA處理之下，龍眼EC中4個HD-Zip成員呈現出了4種表達模式，其中DLHB1-3在50、500 μmol/L ABA處理下呈現上調表達，而在5000 μmol/L ABA處理下呈現下調表達;DLHB2-1在50、5000 μmol/L ABA處理下呈現上調表達，而在500 μmol/L ABA處理下呈現下調表達;DLHB3-3在500、5000 μmol/L ABA處理之下呈現上調表達，而在50 μmol/L ABA處理下呈現下調表達;DLHB4-6在50、500、5000?μmol/L ABA處理下均呈現上調表達;其次，值得關注的是，在50 μmol/L的ABA處理之下，DLHB1-3、DLHB2-1、DLHB4-6都呈現出了上調表達的趨勢，且上調表達顯著，暗示在該濃度ABA處理之下，這些成員在EC的形態(tài)建成中起到了重要的作用。

總的來說，在不同濃度的ABA處理之下，龍眼HD-Zip在EC中主要呈現出了上調表達的趨勢，暗示該家族成員參與了ABA信號的傳導，并且可能通過正向調節(jié)ABA的濃度，進而參與龍眼EC的形態(tài)建成。

2.5龍眼HD-Zip在龍眼不同體胚中的表達模式分析

為進一步了解龍眼HD-Zip在不同體胚中發(fā)育的機制，本實驗隨機挑選了4個家族成員（DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-1、DLHB4-5）在龍眼不同體胚階段進行熒光定量分析。結果如圖8所示：首先，在龍眼早期體胚的EC到GE發(fā)生階段，4個家族成員呈現出了2種表達模式，在ICpEC與GE中都下調的基因有（DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5），并且下調表達顯著;在ICpEC中下調而在GE中上調表達的基因為DLHB4-1，并且此基因在GE中上調表達顯著;其次在NEC中，DLHB4-1上調表達顯著，DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5下調表達顯著。可見，龍眼HD-Zip家族成員在不同體胚階段的表達模式呈現出共性以及互異性，提示在不同體胚的形態(tài)建成中，該家族成員的作用不盡相同。DLHB4-1在NEC與GE中上調表達顯著，促進了NEC與GE的形態(tài)建成，DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5參與調控不同體胚的發(fā)育?？偟膩碚f，龍眼HD-Zip家族成員參與調控龍眼不同體胚的發(fā)育。

3??討論

3.1龍眼HD-Zip的生物學功能具有多樣性

本研究檢測了4種類型的可變剪接方式（外顯子跳躍、3ˊ端可變剪接、內含子保留、5ˊ端可變剪接），發(fā)現龍眼HD-Zip的可變剪接方式主要以內含子保留為主。且在本研究中發(fā)現在龍眼花、花蕾、果肉這些組織器官以及早期胚胎發(fā)育階段的ICpEC時期，內含子保留的可變剪接發(fā)生事件均達到了較高值，猜測這種可變剪接方式可能參與了龍眼胚胎發(fā)生和果實成熟的重要過程。此前在草莓中就進行了受精前后的可變剪接事件對比，發(fā)現內含子保留率顯著性下降，表明內含子保留參與了果實發(fā)育的過程^[36];擬南芥中的AtBUD13基因通過影響pre-mRNA剪接，從而在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮著關鍵的作用，并且AtBUD13突變主要導致內含子的保留^[27]。這一系列的研究表明，內含子保留方式的可變剪接在植物的生長與發(fā)育中非常重要，并為龍眼HD-Zip的內含子保留方式參與體胚發(fā)生過程以及果實發(fā)育提供了可能。

通過對龍眼HD-Zip家族進行調控miRNA預測，發(fā)現龍眼HD-Zip基因家族成員主要受到了miR166a和miR444b的調控，且前者受到調控的全部為第Ⅲ亞家族的成員（DLHB3-1、DLHB3-2、DLHB3-3、DLHB3-4）;后者受到靶向調控的全部為第Ⅳ亞家族的成員（DLHB4-5、DLHB4-6）。推測miR166a以及miR444b在龍眼HD-Zip家族中起到了重要的作用。據以往的研究報道可知，miRNA165和166能夠切割它們的HD-ZipⅢ基因的靶mRNA，從而調節(jié)這些基因的功能^[37]，與本研究中預測的HD-ZipⅢ主要受miR166a的調控的結果相符;miRNA166的前體以及成熟體參與龍眼早期階段體胚的形態(tài)建成以及激素的響應^[18]，推測miRNA166a可能也通過調控龍眼HD-Zip進而參與龍眼體胚的形態(tài)建成;miR444通過編碼多種蛋白（如MADS），在玉米花的發(fā)育中起了重要的作用^[38]，而HD-ZipⅣ恰好具有參與花發(fā)育的功能^[10]，猜測龍眼HD-ZipⅣ成員通過受到miRNA444b的靶向調控，參與了花發(fā)育的過程。可見，龍眼HD-Zip可能通過參與miRNA的調控過程，進而參與激素的響應過程，體胚形態(tài)建成以及花的發(fā)育等多種植物生長發(fā)育過程。

總的來說，龍眼HD-Zip的AS方式以及受到miRNA的靶向調控，都為其生物學功能的多樣性提供了可能，但AS以及miRNA對龍眼HD-Zip在胚胎中的調控機制，還需進一步深入的研究。

3.2龍眼HD-Zip可能參與ABA信號傳導以及參與調控不同體胚的發(fā)育

根據對龍眼HD-Zip家族的啟動子順式作用元件中的激素響應元件進行分析，我們得知此家族成員中含有多種激素響應元件（脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、赤霉素響應元件、生長素響應元件以及水楊酸響應元件），由此猜測龍眼HD-Zip家族可能參與激素的響應過程。據此，本研究通過對不同濃度的ABA（0、50、500、5000?μmol/L）處理，對龍眼HD-Zip部分基因在EC中的表達模式進行分析，發(fā)現龍眼HD-Zip不同亞家族成員對ABA的響應程度不同，但在不同激素處理之下均出現了上調或者下調的表達，且主要以上調表達為主。據以往在水稻中的報道稱，Oshox22（HD-ZipI）通過ABA介導的信號轉導途徑影響ABA生物合成^[6]，可見HD-Zip家族成員確實參與了ABA的信號傳導;同時ABA也在胚胎發(fā)育中又起著重要的作用^[29]，由此推測龍眼HD-Zip可能參與ABA信號的傳導，通過調節(jié)ABA的濃度進而影響胚性愈傷組織的生長發(fā)育以及形態(tài)的建成。同時為深入了解龍眼HD-Zip在龍眼胚胎發(fā)育中的機制，本研究通過對龍眼HD-Zip部分家族成員在不同體胚中的表達模式進行分析，發(fā)現不同成員呈現的表達模式不盡相同，其中DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5的表達模式較為一致，在NEC、ICpEC與GE中均表現出了下調表達，DLHB4-1在NEC與GE中顯著表達。該結果提示龍眼HD-Zip家族成員參與調控體胚的發(fā)育，且部分成員可能在某些體胚的形態(tài)建成中起到了重要的促進作用。EgHOX1（HD-ZipII）在油棕的早期胚胎中呈現高表達^[39];大多數HD-ZipⅣ基因在香蕉的體細胞胚中高度表達^[40];擬南芥的REV、PHB、PHV首先于胚胎發(fā)育過程中的球形胚的頂端中部表達^[41]，與龍眼HD-Zip成員在EC與ICpEC中就出現表達的情況不太一致，但同樣參與體胚的發(fā)育過程?？梢?，HD-Zip與體胚的生長密切相關，也為龍眼HD-Zip參與調控不同體胚的發(fā)育提供了可能。

總之，龍眼HD-Zip可能既參與ABA的信號傳導過程又參與調控不同體胚的發(fā)育。此前有研究報道，miRNA166的前體和成熟體在ABA處理之下在龍眼EC階段呈現出了不同的表達模式^[18]，結合本研究的miRNA預測，我們猜想龍眼HD-ZipⅢ成員在表達過程中可能與miRNA166a以及ABA構建了一個復雜的調控網絡，進而參與EC的形態(tài)建成。總之，龍眼HD-Zip在胚胎發(fā)育中的作用，值得我們后續(xù)更加深入的分析。

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