普通煙草碳酸酐酶家族基因的生物信息學(xué)分析

趙希勝 曾鼎宸 呂承承 蔣垚 童鑄 吳潤生 李立芹 魯黎明

摘??要：為挖掘普通煙草碳酸酐酶基因的信息并探討其功能，本研究利用生物信息學(xué)方法，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中對普通煙草碳酸酐酶家族成員進(jìn)行了檢索，并對其理化性質(zhì)、遺傳進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序、順式作用元件和組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在普通煙草中至少含有9個α和6個β亞家族成員。在進(jìn)化關(guān)系上，不同亞家族成員之間，序列同源性較低;與水稻相比，擬南芥和普通煙草兩個亞家族間的親緣關(guān)系較近。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，煙草α亞家族成員在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞器中均有分布，而β亞家族成員均存在于葉綠體中?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分析說明，各亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序呈現(xiàn)較高的一致性。啟動子順式作用元件分析顯示，煙草碳酸酐酶基因的啟動子中，均含有多個參與光反應(yīng)、激素響應(yīng)、非生物脅迫和機(jī)械損傷等相關(guān)的順式作用元件?；蚪M織表達(dá)模式分析表明，煙草的碳酸酐酶基因不同成員在不同組織表達(dá)水平存在差異，并呈現(xiàn)出時空特異性。本研究結(jié)果為煙草碳酸酐酶基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草;碳酸酐酶;生物信息學(xué);基因結(jié)構(gòu);表達(dá)

中圖分類號：S572.03 ?????????文章編號：1007-5119（2019）05-0068-09 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.05.010

Abstract：In order to find out the information of carbonic cnhydrase （CA）?genes in tobacco and explore their?functions， the members of common tobacco CA?family were identified?from?the tobacco genome database， and the physical and chemical properties， genetic evolution， gene structure， conserved motifs of proteins， cis-acting elements and tissue expression patterns were analyzed. The results showed that there were at least 9 alpha and 6 beta subfamily members in tobacco. On evolutionary relations， lower sequence homology was observed between different subfamily members. Compared with rice， CA members betweenArabidopsis thalianaand common tobacco are more closely related. Subcellular localization analysis showed that tobacco alpha subfamily members were distributed in cell wall， cell membrane， mitochondria， chloroplast， cytoplasm and other organelles， while beta subfamily members were present in chloroplast. The analysis of gene structure and conserved motifs showed that the gene structure and conserved motifs of proteins?of each subfamily were highly consistent. Analysis of the cis-acting elements of the promoter showed that the promoter of the carbonic anhydriase genes in tobacco contains several cis-acting elements involved in light reaction， hormone response， abiotic stress and mechanical damage.?The expression pattern analysis?confirmed that the expression levels of carbonic anhydrase genes in different subfamilies of tobacco were different in different tissues and showed the specificity of time and space.?The results of this study laid a foundation for the functional study of tobacco carbonic anhydrase genes.

Keywords： tobacco; carbonic anhydrase; bioinformatics; gene structure; expression

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase; CA; EC 4.2.1.1）是一種與光合作用密切相關(guān)的金屬酶，能夠高效可逆地催化CO₂與HCO₃^-之間的轉(zhuǎn)化，是CO₂濃縮機(jī)制的重要組分^[1]。生物體內(nèi)的碳酸酐酶是一個多基因家族，目前依據(jù)晶體結(jié)構(gòu)和亞基組成，可將其分為α、β、γ、δ、ε及θ等6個亞家族，盡管這些亞家族成員之間的氨基酸序列差異較大，但其活性中心均含有催化作用必不可少的鋅離子^[2-3]。在高等植物中，主要含有α、β、γ三個亞家族^[4]。其中α亞家族主要以單體的形式存在，大部分成員由10條β鏈圍成一個大的β片區(qū)活性中心，其外圍被7個α螺旋所包圍。而β亞家族最早在植物中被鑒定^[5]，β亞家族成員的Zn²⁺與一個組氨酸、兩個半胱氨酸和一個水分子配位形成不規(guī)則的四面體位于活性中心部位^[6]，其主要鑒別模式為C-[SA]-D-S-R-[LIVM]-x-[AP]^[7]。截至目前，在擬南芥中已克隆了8個α、6個β、3個γ和2個γ-like基因^[8-9];水稻、玉米、高粱和谷子中各鑒定了2個、5個、5個和4個與C4光合通路相關(guān)的β亞家族基因^[10-11];此外，小黑楊、紅藻和衣藻等植物的CA家族基因也相繼被鑒定和克隆^[12-14]。

高等植物碳酸酐酶的主要功能是參與光合作用，如將衣原體CA基因過表達(dá)于煙草后顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的光合速率和生物學(xué)產(chǎn)量^[15]。水稻OsβCA1突變體植株和RNAi株系均表現(xiàn)出生物學(xué)產(chǎn)量和CA活性明顯降低^[16]。除此之外，CA還參與了植物呼吸作用、pH調(diào)節(jié)、氨基酸及脂質(zhì)的代謝、氣孔運動、非生物脅迫等生理過程^[17]。如玉米碳酸酐酶突變體植株的氣孔導(dǎo)度明顯高于野生型，并隨著CO₂分壓的增加，氣孔關(guān)閉速度變慢^[18]，HU等^[19]在研究擬南芥CA突變體時也得到了類似的結(jié)果。FROMM等^[20]和PERALES等^[21]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥γ-CAs在線粒體電子傳遞和光呼吸中起著重要作用。HOANG等^[22]將棉花碳酸酐酶活性抑制后，發(fā)現(xiàn)其脂質(zhì)的合成速率顯著降低。在擬南芥βca2βca4雙突變體葉片中，氮的同化受到阻遏^[23]。煙草葉綠體碳酸酐酶基因在酵母中表達(dá)后，其抗氧化活性顯著增強(qiáng)^[24]。TIANPEI等^[25]將水稻OSCA基因異源表達(dá)后也發(fā)現(xiàn)，其活性氧含量明顯降低，并增強(qiáng)了對熱應(yīng)激的耐受性。水稻OsCA1基因過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因幼苗的耐鹽性顯著增強(qiáng)^[26]。

普通煙草（Nicotiana tabacum）是一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，因此，深入探討碳酸酐酶在煙草光合作用中的地位與作用，具有重要的理論意義與實踐

價值。然而，作為一個多功能基因家族，煙草的碳酸酐酶研究卻較為薄弱。所以，本研究采用生物信息學(xué)手段，對普通煙草碳酸酐酶α和β兩個亞家族進(jìn)行了檢索，并對其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守motif、啟動子順式作用元件以及組織表達(dá)模式等進(jìn)行了分析，以期為煙草碳酸酐酶基因的功能研究提供借鑒。

1 ?材料與方法

1.1 ?普通煙草CA家族成員的鑒定

從TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫下載擬南芥已鑒定的α-CA和β-CA蛋白全長序列，通過本地Blast檢索普通煙草蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/，e-value值為1e-5）^[27-28]。從pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）分別下載α-CA和β-CA的隱馬爾可夫（HMM）模型（α-CA：PF00484;β-CA：PF00494），利用HMMER 3.0?檢索煙草蛋白數(shù)據(jù)庫（e-value值為1e-5）。將以上兩種方式獲得的蛋白序列，利用Perl去除冗余后，通過pfam、CDD和SMART軟件進(jìn)一步驗證結(jié)構(gòu)域信息，剔除不完全序列，最終獲得普通煙草α-CA和β-CA基因家族成員。

1.2 ?基本理化性質(zhì)分析

利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/），在線預(yù)測普通煙草α和β碳酸酐酶蛋白的分子量、等電點。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）網(wǎng)站，進(jìn)行疏水性分析。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 ?同源性分析

從Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/?portal.html）下載水稻已鑒定的α-CA與β-CA亞家族成員。利用MEGA7.0軟件將獲得的普通煙草與擬南芥和水稻所有的α-CA與β-CA兩個亞家族成員的蛋白序列進(jìn)行比對后，采用鄰接法構(gòu)建發(fā)育樹（Bootstrap值為1000）。

1.4 ?蛋白保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

將煙草α和β亞家族蛋白序列利用MEGA 7軟件進(jìn)行聚類，從茄科基因組數(shù)據(jù)庫下載普通煙草基因組數(shù)據(jù)文件，利用TBtools（https：//github.com/ CJ-Chen/TBtools）提取α-CA與β-CA基因結(jié)構(gòu)信息并進(jìn)行可視化。利用MEME軟件（http：//meme- suite.org/tools/meme）預(yù)測α-CA和β-CA家族蛋白保守基序（參數(shù)設(shè)置：motif最大值為10，motif長度范圍在6～100之間）。

1.5 ?啟動子順式作用元件分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫截取普通煙草兩個CA亞家族成員起始密碼子（ATG）上游2000?bp，利用PlantCARE在線工具^[29]，預(yù)測各基因啟動子順式作用元件，并進(jìn)行繪圖。

1.6 ?基因表達(dá)模式分析

在GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）數(shù)據(jù)庫，下載普通煙草K326根（Root）、芽（Shoot）、莖尖（Shoot Apex）分別在0、6、12、18 h的表達(dá)數(shù)據(jù)（GSE95717）。利用TopHat2軟件，將本研究獲得的普通煙草α和β碳酸酐酶成員依次檢索并提取相應(yīng)表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行均一化處理后利用Mev軟件作圖。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?普通煙草CA家族基因的鑒定

利用本文1.1所述的兩種方法獲得煙草CA候選序列，利用CDD、SMART和Pfam等蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測工具進(jìn)一步驗證，最終在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中檢索出了9個α-CA和6個β-CA基因，分別命名為NtCA1～9及NtCA10～15（表1），其DNA序列長度介于1716～14114 bp之間。

2.2 ?基本理化性質(zhì)分析

由表1看出，α-CA亞家族的NtCA1～9編碼的氨基酸殘基數(shù)量為197～275個，分子量在22.42～31.10 kDa，理論PI值均大于7.0。β-CA亞家族的NtCA10～15所編碼的氨基酸數(shù)量為250～340個，分子量在27.33～37.75 kDa，其理論PI值3個成員大于7.0，另外3個成員均在5～7之間。

親/疏水性分析顯示，兩個亞家族所有成員均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，α-CA家族成員分布于細(xì)胞壁、葉綠體、細(xì)胞膜、線粒體等細(xì)胞器上。有趣的是，NtCA3、NtCA4、NtCA7和NtCA8在多個細(xì)胞器中均有分布，而β-CA主要分布在葉綠體上。

2.3 ?序列相似性與同源性分析

由表2看出，α-CA與β-CA亞家族之間的序列相似度較低，如NtCA1和NtCA11序列相似度僅為7.7 %;而亞家族內(nèi)各成員的序列相似度較高，如α-CA亞家族中，NtCA2和NtCA5的相似度高達(dá)87.7%。

為了明確煙草15個CA成員與水稻及擬南芥CA成員的同源性，將擬南芥8個α-CA（AtCA1-8）和6個β-CA（AtCA9-14）的氨基酸序列，及從Phytozome

下載的水稻8個α-CA（OsCA1-8）和2個β-CA（OsCA9-10）的氨基酸序列，連同這15個普通煙草的CA成員一起比對，并構(gòu)建NJ樹（圖1）?？梢悦黠@看出，參與NJ樹構(gòu)建的所有β-CA成員，均很好地聚為一類，而α-CA亞家族成員根據(jù)自舉值被分為兩類，說明不同CA亞家族成員在進(jìn)化上具有相對獨立性。此外，整體上看，普通煙草與擬南芥兩個CA亞家族成員之間的親緣關(guān)系更近一些。

2.4 ?保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

聚類分析的結(jié)果表明（圖2A），煙草CA15個成員聚為兩類，其中，NtCA1至NtCA9為一類，NtCA10至NtCA15聚為另外一類。Motif分析表明，煙草所有α-CA家族成員均含有Motif1、Motif2和Motif5。所有β-CA亞家族成員均包含Motif3、Motif4和Motif6（圖2B、2D）。

基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖2C），煙草α-CA亞家族各成員外顯子個數(shù)在6～7之間，而β-CA成員則在8～10之間，β-CA亞家族成員的外顯子數(shù)目要多于α-CA亞家族，說明β-CA亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)較α-CA亞家族復(fù)雜，其中所蘊(yùn)藏的生物學(xué)意義值得探索。

2.5 ?啟動子順式作用元件分析

煙草15個CA基因的啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，在這些基因的啟動子中，含有多個參與光響應(yīng)、激素、非生物脅迫等相關(guān)的順式作用元件及多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。比如，控制光反應(yīng)的相關(guān)元件ACE、I-box、Box4、G-Box和TCT-motif等^[30];參與干旱誘導(dǎo)的MBS元件^[31];參與低溫應(yīng)答的LTR元件^[32];參與MeJA響應(yīng)的CGTCA-motif和TGACG-motif;參與ABA相關(guān)的ABRE調(diào)控元件;參與GA響應(yīng)的GARE-motif和P-box元件^[31];參與SA和IAA響應(yīng)的TCA-element^[33];參與乙烯響應(yīng)的ERE元件^[32];與厭氧誘導(dǎo)調(diào)控相關(guān)的ARE元件^[31];與機(jī)械損傷相關(guān)的WUN-motif元件^[34];以及分生組織表達(dá)相關(guān)元件CAT-box和參與多種脅迫應(yīng)答的MYC元件和W-box等^[35]（圖3）。此結(jié)果暗示，煙草的碳酸酐酶基因可能廣泛參與了煙草的生長發(fā)育過程及外界脅迫響應(yīng)。

2.6 ?基因表達(dá)模式分析

基因表達(dá)數(shù)據(jù)的結(jié)果顯示（圖4），總體上看，NtCA15、NtCA14和NtCA12在所有組織及所有時間點的表達(dá)水平均較高;而NtCA2、NtCA3、NtCA5、NtCA8及NtCA9的表達(dá)水平均較低。在α-CA亞家族中，NtCA1和NtCA6在18?h內(nèi)不同組織中均有表達(dá)，在根部表達(dá)量較其他組織高;而NtCA4和NtCA7也主要在根部表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量較低。在β-CA成員中，雖然各基因在不同組織、不同時間段均有表達(dá)，但其表達(dá)水平卻存在差異，比如NtCA15在芽和莖端的表達(dá)量顯著高于根部，NtCA10在根部12 h的表達(dá)量顯著高于0 h。本結(jié)果表明，煙草CA基因的表達(dá)具有組織及時空特異性，也更進(jìn)一步反映出煙草CA功能的多樣性與廣泛性。

3 ?討 ?論

本研究通過生物信息學(xué)方法，從煙草基因組數(shù)據(jù)庫中，檢索出了分屬α及β碳酸酐酶亞家族的15個基因。同源性分析顯示，普通煙草α及β-CA亞家族基因，相對于水稻，與擬南芥相應(yīng)基因的同源性更高。此外，從煙草碳酸酐酶編碼蛋白的氨基酸序列相似度看，α及β亞家族之間的相似度較低，而亞家族內(nèi)相對較高，也同樣表明在進(jìn)化上亞家族內(nèi)基因的變異要小于亞家族間。在基因結(jié)構(gòu)方面，煙草碳酸酐酶α亞家族基因的外顯子個數(shù)在6～7，而β亞家族大多數(shù)在8～10，這與水稻、玉米和擬南芥的CA家族基因結(jié)構(gòu)類似^[36]。同時，Motif分析結(jié)果顯示，煙草碳酸酐酶α亞家族基因均含有Motif1、Motif2和Motif5。這些Motif中都存在3個與鋅離子配位的組氨酸和形成活性位點相關(guān)的保守氨基酸殘基;而β亞家族基因則均含有Motif3、Motif4和Motif6，該保守結(jié)構(gòu)域包含了兩個半膀氨酸和一個組氨酸殘基及β類碳酸酐酶所特有的保守性基序C-[SA]-D-S-R-[LIVM]-x-[AP]^[7-8]。此結(jié)果一方面表明了植物碳酸酐酶基因在進(jìn)化上的保守性，另一方面也表明了其基因結(jié)構(gòu)的多樣性與復(fù)雜性。而這種結(jié)構(gòu)上的多樣性與復(fù)雜性，為植物碳酸酐酶超家族基因的功能多樣性奠定了基礎(chǔ)。

基因的啟動子區(qū)域包含有不同的順式作用元件。這些元件的種類與數(shù)量，在很大程度上影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而使其在不同生理過程中行使著不同的功能。在本研究中，煙草15個CA基因的啟動子區(qū)域，均鑒定出了多個與光反應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，暗示著煙草的CA基因可能參與了光合作用。此外，還鑒定出了一些響應(yīng)環(huán)境脅迫相關(guān)的元件以及參與激素響應(yīng)的順式作用元件。本結(jié)果表明，普通煙草的碳酸酐酶基因可能廣泛參與了煙草的生長發(fā)育與脅迫響應(yīng)過程。

基因在植物不同組織中的表達(dá)水平，反映了其主要發(fā)揮功能的場所。本研究通過煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了煙草15個CA基因18 h之內(nèi)在不同組織中的表達(dá)量。與擬南芥的研究結(jié)果相類似^[8]，煙草的CA基因在不同組織中表達(dá)水平不一。其中，屬于β亞家族的NtCA12、NtCA14和NtCA15這3個基因在所有組織中的表達(dá)均較強(qiáng)，暗示著其在煙草碳酸酐酶基因中的重要地位。與此相對應(yīng)的是屬于α亞家族的NtCA2、NtCA3、NtCA5、NtCA8及NtCA9，它們在所有組織中的表達(dá)水平均較低。

對普通煙草碳酸酐酶家族基因的鑒定與分析，只是其功能鑒定的第一步。其在煙草生長發(fā)育及逆境響應(yīng)中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，有待于更進(jìn)一步的深入研究。

4 ?結(jié) ?論

在普通煙草中檢索出屬于碳酸酐酶家族的9個α-亞家族與6個β-亞家族成員。所有成員均分別含有α-、β-亞家族功能結(jié)構(gòu)域，其啟動子中包含多個參與光、激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。煙草碳酸酐酶基因的表達(dá)具有組織特異性，并可能廣泛參與了煙草的生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)。本研究結(jié)果為煙草碳酸酐酶基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。煙草碳酸酐酶基因在光合作用以及非生物脅迫響應(yīng)中的功能與作用機(jī)制，則成為下一步研究的重點。

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