微生物碳酸酐酶特性研究

洪子茜

（四川師范大學(xué)，四川成都 610101）

在研究喀斯特地貌形成過(guò)程中，地質(zhì)學(xué)家發(fā)現(xiàn)微生物碳酸酐酶可能加速石灰石的溶解，其主要成分是碳酸鹽，對(duì)鈣和鎂離子的溶解貢獻(xiàn)很大[1-2]。碳酸酐酶在自然界中廣泛分布，并能夠催化二氧化碳（CO2）的可逆水化反應(yīng)至HCO3-，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益。到目前為止，已經(jīng)描述了十六種同工酶[3]，它們的亞細(xì)胞定位、催化活性和對(duì)不同種類抑制劑的敏感性不同。

1 酸酐酶捕獲二氧化碳能力

微生物碳酸酐酶是由多種組織產(chǎn)生的，它們參與了一系列重要的生物過(guò)程，如酸堿平衡、呼吸、二氧化碳和離子轉(zhuǎn)運(yùn)、體細(xì)胞生成等[4]?；谏锏牟东@系統(tǒng)是二氧化碳捕獲技術(shù)改進(jìn)的潛在途徑。這些系統(tǒng)基于二氧化碳在活生物體中自然發(fā)生的反應(yīng)，其中一種可能性是酶的作用，如碳酸酐酶。作為可替代的工業(yè)過(guò)程，碳酸酐酶具有捕獲二氧化碳的潛力，以減少二氧化碳排放到大氣中[5]。捕獲可以通過(guò)酶的二氧化碳水合和隨后的碳酸鹽礦物形式的化學(xué)反應(yīng)來(lái)完成，其具有存在于自然中的天然優(yōu)點(diǎn)。在使用碳酸酐酶捕獲二氧化碳時(shí)，很少使用高度純化的酶制劑。因此，有必要用經(jīng)濟(jì)適用的低純度酶提取液進(jìn)行捕獲，這是通過(guò)工業(yè)應(yīng)用的純化技術(shù)獲得的，從而降低了捕獲和封存二氧化碳的成本。

2 酸酐酶活性

碳酸酐酶活性試驗(yàn)是在布勞內(nèi)爾等方法改進(jìn)后進(jìn)行的，在2℃冷凍反應(yīng)室中，分別將4.5毫升冰冷的新制備的二氧化碳飽和水加入到0.5毫升煮沸和未煮沸的碳酸酐酶液體中，并測(cè)試單位pH值下降所用的時(shí)間。酶活性單位可以根據(jù)公式計(jì)算，蛋白質(zhì)的測(cè)試是指勞里等人的方法。碳酸酐酶活性以每毫克蛋白質(zhì)（U/mg）中所含的單位酶活性來(lái)表示。

3 碳酸酐酶的提取

通常用氯仿和乙醇提取碳酸酐酶。如表1所示，對(duì)四種不同比例的氯仿和乙醇對(duì)酶的提取和純化進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將懸浮液攪拌并分離，除去過(guò)量的氯仿和沉淀，上清液除去任何殘留沉淀物。

表1 采用水、乙醇和氯仿的比例進(jìn)行研究

利用硫酸銨沉淀法純化碳酸酐酶。將碳酸酐酶提取液置于錐形溶液中，加入不同量的硫酸銨，得到10%～80%的硫酸鈉。在10℃下放置14小時(shí)后，4℃下將4700 g樣品分離30分鐘，分離上清液，將沉淀懸浮在去離子水中。在上清液和沉淀物中測(cè)定酶活性和總蛋白含量。

純化的碳酸酐酶被用來(lái)作為二氧化碳捕獲的催化劑，以CaCO3的形式沉淀。反應(yīng)混合物包括：7.5毫升純化酶提取液，7.5毫升1.2M的Tri-HCl緩沖液，含有4.5%（W/V）氯化鈣的溶液（pH值為10.5）和30毫升二氧化碳溶液。用氣態(tài)二氧化碳將去離子水在壓力為0.1 MPa和溫度為5℃的條件下制備二氧化碳溶液，當(dāng)二氧化碳溶液加入到密封環(huán)境中時(shí)，反應(yīng)開(kāi)始。在所有實(shí)驗(yàn)中，將溫度保持在5℃，然后分別在10分鐘和20分鐘的反應(yīng)后對(duì)混合物進(jìn)行過(guò)濾和干燥，以確定CaCO3沉淀的重量（酶測(cè)定法）。同時(shí)，用去離子水代替酶（非酶法）制備樣品，并將結(jié)果表示為酶法測(cè)定值與非酶法測(cè)定值之間的差值。為了在二氧化碳捕獲中使用，用硫酸銨沉淀法純化酶需要除去鹽，反應(yīng)于4℃進(jìn)行。

4 碳酸酐酶穩(wěn)定性測(cè)試

4.1 微生物碳酸酐酶熱穩(wěn)定性的研究

提取的碳酸酐酶分別在10℃、40℃和60℃下分別處理15分鐘、30分鐘和45分鐘，并對(duì)酶處理活性進(jìn)行測(cè)試。從處理時(shí)間可以看出，三個(gè)不同處理時(shí)期相對(duì)酶活性的變化趨勢(shì)是一致的。在相同的溫度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性下降，但在30℃時(shí)，酶在30分鐘處理期間的相對(duì)活性比15分鐘處理提高約7%，但45分鐘處理的活性低于15分鐘和30分鐘。但隨著時(shí)間不斷增長(zhǎng)，碳酸酐酶的活性可能丟失。從處理溫度來(lái)看，碳酸酐酶的活性保持在10～30℃，特別是在20℃時(shí)，酶活性提高到一定水平。當(dāng)處理15分鐘時(shí)，活性提高12%，但當(dāng)溫度升高至40℃時(shí)，活性可能下降到80%以下。超過(guò)50℃后，活性明顯下降，15分鐘后只剩下50%的活性。此外，酶活性將繼續(xù)下降，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，活性僅維持在20%以下，說(shuō)明高溫可以抑制碳酸酐酶的活性。當(dāng)溫度在10～40℃之間時(shí)，酶可以保持良好的活性，因此，用碳酸酐酶處理循環(huán)冷卻水系統(tǒng)不應(yīng)太高，或者酶的作用可能受到嚴(yán)重影響。酶的預(yù)處理應(yīng)在放入高溫系統(tǒng)之前進(jìn)行。Raju指出，用凝膠材料固定碳酸酐酶可以提高酶的穩(wěn)定性和使用期限。

4.2 pH對(duì)微生物碳酸酐酶的影響

提取的碳酸酐酶分別在pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0中分別處理1小時(shí)，并對(duì)其酶活性進(jìn)行檢測(cè)。

4.3 金屬陽(yáng)離子對(duì)微生物碳酸酐酶的影響

制備了一定濃度的 Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Hg2+、K+和Na+金屬陽(yáng)離子溶液，然后將其與萃取的碳酸酐酶以一定比例混合，使金屬離子混合物的濃度分別達(dá)到0.01moL/L、0.10moL/L和1.00moL/L，并在室溫下放置1小時(shí)，對(duì)處理后的酶活性進(jìn)行測(cè)試。

4.4 陰離子和抑制劑對(duì)微生物碳酸酐酶的影響

制備了一定濃度的SO42-、NO3-、Cl-、Br-和 I-陰離子溶液，以及乙酰唑胺、磺胺和氰化物，然后在一定比例下與萃取的碳酸酐酶混合，使混合離子濃度達(dá)到設(shè)計(jì)濃度。將混合物置于室溫下1小時(shí)，并測(cè)定處理后的酶活性，以確定陰離子對(duì)碳酸酐酶濃度的影響。

測(cè)試結(jié)果采用方差分析和Tukey檢驗(yàn)，考慮95%的置信水平（P＜0.05）。

5 氯仿-乙醇萃取法分離碳酸酐酶

用乙醇沉淀法和氯仿法對(duì)四種酶進(jìn)行了提取和純化。結(jié)果顯示在表2中。表2表明PF在統(tǒng)計(jì)學(xué)上相似（P＜0.05）。對(duì)于%R，在試驗(yàn)中獲得了該反應(yīng)的最高值（98%），與其他酶活性（2623 U/mL）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 用乙醇和氯仿提取碳酸酐酶中的酶活性、回收率和純化因子的方法和標(biāo)準(zhǔn)偏差

6 碳酸酐酶溶解碳酸鈣的性能研究

將碳酸鈣大顆粒研磨，取1克碳酸鈣顆粒，分別放入幾個(gè)1升錐形燒瓶中。同時(shí)，在燒瓶中加入500.0毫升去離子水。設(shè)置了三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，加入10.0mL碳酸酐酶作為實(shí)驗(yàn)組，加入10.0毫升碳酸酐酶和碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺作為對(duì)照組，1×10-4mol/L，此外，加入10.0毫升去離子水作為空白組。在室溫下應(yīng)放置三組錐形燒瓶，以80轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖動(dòng)，每隔2小時(shí)后取樣。實(shí)驗(yàn)持續(xù)24小時(shí)。將樣品用于pH值、電導(dǎo)率、Ca2+濃度和總硬度的測(cè)定，從而研究碳酸酐酶對(duì)碳酸鈣溶解的影響。

當(dāng)使用硫酸銨沉淀技術(shù)時(shí)，首要掌握的是蛋白質(zhì)和任何干擾物沉淀的鹽濃度的范圍，從而允許生物分子的純化。在本例中，通過(guò)改變硫酸銨飽和度在10%和80%之間進(jìn)行試驗(yàn)。在10%和50%的飽和百分率下沒(méi)有蛋白沉淀，因此在這些百分比下沒(méi)有分析活性。在70%和80%之間的飽和百分比中，觀察到酶（CA）和血紅素都完全沉淀，因此不可能將兩者分離。然而，在使用60%硫酸銨飽和的試驗(yàn)中，大部分的鈣沉淀，相當(dāng)數(shù)量的酶留在上清液中。根據(jù)這些結(jié)果，用硫酸銨飽和60%和硫酸銨65%倍進(jìn)行了新的試驗(yàn)，得到了酶活性、PF和酶活性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

%R顯示在表3中，在95%置信水平上的平均值沒(méi)有顯著性差異。從表3可以看出，在60%和65%飽和度下得到的上清液中的%R以及在兩種沉淀中得到的%R和PF的值基本相同（P＜0.05）。此外，在上清液和沉淀（60%飽和度）中回收的血紅蛋白的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是相等的。60%的飽和度是PF（1.4倍）和%R（66%）的最佳結(jié)果。65%的飽和不足以滿足酶的要求，因?yàn)閹缀跛械难虻鞍锥茧S著鈣沉淀，不可能分離這兩類分子。用該方法測(cè)定的PF值低于乙醇/氯仿法測(cè)定的PF值。然而，根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用，不需要高程度的純化因子，但有必要驗(yàn)證任何殘留血紅蛋白對(duì)二氧化碳捕集目的碳酸酐酶性能的影響。

7 結(jié)論

本文研究了微生物碳酸酐酶的特性，研究了碳酸鈣顆粒對(duì)碳酸酐酶的溶解作用。最后，在二氧化碳捕集實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果表明，提取的碳酸酐酶不僅提高了二氧化碳的水合作用，而且促進(jìn)了CaCO3的形成。

表3 用硫酸銨沉淀碳酸酐酶的酶活力、純化因子和回收率和血紅蛋白回收率

結(jié)果表明，在10～40℃的環(huán)境中，酶能保持良好的活性，但一旦溫度超過(guò)60℃，酶活性可能受到嚴(yán)重的影響。在中性和堿性環(huán)境中，即pH值在7.0～9.0時(shí)，對(duì)碳酸酐酶活性的影響最小，在酸性環(huán)境中對(duì)酶活性有嚴(yán)格的限制。Ca2+、Mg2+、K+和Na+對(duì)碳酸酐酶的活性影響不大，但Fe2+和Zn2+的濃度對(duì)碳酸酐酶的活性有增強(qiáng)作用，Zn2+的增強(qiáng)作用極為明顯，Hg2+對(duì)碳酸酐酶的活性有嚴(yán)重的影響。碳酸酐酶SO42-濃度為 200 .0 MoL/L，Cl-為 180.0MoL/L。NO3-、I-和Br-在一定程度上抑制了碳酸酐酶。