卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達變化及其臨床意義

陸娟，劉晶晶，戰(zhàn)姝妍

(本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪117000)

卵巢癌是一種嚴重威脅全球婦女健康的惡性腫瘤，在婦科惡性腫瘤中其發(fā)病率居第二位、病死率居第一位。卵巢癌起病隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)且易轉移，患者預后往往較差[1]。目前，關于卵巢癌的病因尚不完全清楚。因此，探索卵巢癌形成與惡性進展的分子機制成為當前臨床研究的熱點之一。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt、不具有編碼蛋白質功能的RNA分子，而是以RNA的形式在表觀遺傳、轉錄及轉錄后等層面調控基因的表達，繼而參與機體一系列的生理和病理生理過程[2，3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中亦具有重要作用[4]，有可能成為某些惡性腫瘤的特異性生物標志物和潛在的治療靶點。核富集轉錄體1(NEAT1)是一種長度約3.2 kb的lncRNA，主要富集于細胞核中，是形成與維持細胞核亞結構paraspeckle的關鍵lncRNA。有研究證實，lncRNA NEAT1可參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。羧基末端結合蛋白2(CtBP2)是進化上高度保守的輔助轉錄抑制因子，能通過下調特定的腫瘤抑制因子，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。但目前l(fā)ncRNA NEAT1、CtBP2在卵巢癌形成和惡性進展中的作用尚不清楚。本研究觀察了卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達變化，并探討其表達與患者臨床病理特征和預后的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年3月～2015年12月本溪市中心醫(yī)院收治的卵巢癌患者76例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合原發(fā)性卵巢癌診斷；②根據病情行全面分期手術或腫瘤細胞減滅術；③初診，術前未行任何抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②術前接受抗腫瘤治療者；③年齡>70歲者；④治療依從性差者；⑤術后失訪或因意外去世者。其中，年齡20～69(54.32±7.18)歲，≤55歲45例、>55歲31例；腫瘤直徑：≤3 cm 42例，>3 cm 34例；病理類型：漿液性51例，黏液性20例，其他5例；FIGO分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期33例，Ⅲ、Ⅳ期15例；有淋巴結轉移53例，無淋巴結轉移23例。同期選擇本溪市中心醫(yī)院收治的卵巢良性囊腫患者20例，年齡23～70(55.19±6.65)歲。兩組年齡具有可比性。本研究經本溪市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA NEAT1、CtBP2表達檢測 采用RT-PCR法。取手術切除或剝離的卵巢癌組織與卵巢囊腫組織，液氮下碾磨成粉末，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實驗。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由沈陽萬類生物科技有限公司設計合成。引物序列：lncRNA NEAT1上游引物5′-GGGATGATGCAAACAATTAC-3′，下游引物5′-TACCATACAGAGCAACATAC-3′；CtBP2上游引物5′-ATCCACGAGAAGGTTCTAAACG-3′，下游引物5′-CCGCACGATCACTCTCAGG-3′；GAPDH上游引物5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR反應體系共25 μL：2×SYBR Green qPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 2 μL，去離子水9.5 μL；反應條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 卵巢癌患者術后采用電話或門診等方式定期隨訪，隨訪截至2018年12月，隨訪時間9～60個月、中位隨訪時間33個月。以卵巢癌組織lncRNA NEAT1或CtBP2相對表達量的均數為截斷值，高于截斷值為高表達、低于截斷值為低表達，統(tǒng)計不同lncRNA NEAT1或CtBP2表達者生存時間和生存率。

2 結果

2.1 卵巢癌組織與卵巢囊腫組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達比較 卵巢癌組織與卵巢囊腫組織lncRNA NEAT1相對表達量分別為0.619±0.115、0.079±0.021，CtBP2相對表達量分別為0.330±0.066、0.112±0.014。卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2相對表達量均明顯高于卵巢囊腫組織(t分別為20.831、14.631，P均<0.01)。

2.2 卵巢癌組織lncRNA NEAT1表達與CtBP2表達的關系 Pearson相關分析顯示，卵巢癌組織lncRNA NEAT1相對表達量與CtBP2相對表達量呈正相關關系(r=0.689，P<0.01)。

2.3 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達與患者臨床病理特征的關系 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達均與腫瘤FIGO分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，而與患者年齡、腫瘤直徑、病理類型無關(P均>0.05)。見表1。

表1 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2表達與患者預后的關系 以卵巢癌組織lncRNA NEAT1或CtBP2相對表達量的均數為截斷值，將患者分為lncRNA NEAT1高表達者34例、低表達者42例，CtBP2高表達者35例、低表達者41例。至隨訪截至日期，lncRNA NEAT1高表達者與低表達者生存率分別為47.06%(16/34)、71.81%(31/42)，生存時間分別為(35.85±3.57)、(52.38±3.06)個月，lncRNA NEAT1高表達者生存率和生存時間均低于lncRNA NEAT1低表達者(χ2/t分別為5.698、21.731，P均<0.05)；CtBP2高表達者與低表達者生存率分別為48.57%(17/35)、73.17%(30/41)，生存時間分別為(37.54±3.66)、(52.28±3.03)個月，CtBP2高表達者生存率和生存時間均低于CtBP2低表達者(χ2/t分別為4.842、19.209，P均<0.05)。

3 討論

據調查，我國卵巢癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第8位，居世界第85位，處于較低水平[7]。但由于卵巢癌病死率較高，5年生存率僅30%左右[8]，故仍然是嚴重威脅我國婦女健康的重要疾病之一。近年來隨著我國經濟發(fā)展，居民飲食結構和生活方式改變，卵巢癌的發(fā)病率正逐年上升并呈年輕化趨勢[9]。由于卵巢癌的病因尚不完全清楚，缺少有效的預防措施。因此，探索卵巢癌形成與惡性進展的分子機制成為當前臨床研究的熱點之一。

lncRNA是廣泛分布于真核生物體內的一類非編碼RNA，約占轉錄本的93%[10]。lncRNA序列長，結構復雜，雖然不編碼蛋白質，但特定的lncRNA能夠參與調控蛋白的轉錄或轉錄后表達[2,3]。NEAT1是近年發(fā)現(xiàn)的一種在人體細胞核內表達的lncRNA，是形成與維持細胞核亞結構paraspeckle的關鍵lncRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過調控多種基因的表達，參與機體的免疫調控及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11～13]。Chai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1能夠促進卵巢癌OVCAR-3細胞增殖和侵襲，而敲除lncRNA NEAT1的卵巢癌OVCAR-3細胞增殖和侵襲明顯受到抑制。本研究結果顯示，卵巢癌組織lncRNA NEAT1相對表達量明顯高于卵巢囊腫組織；卵巢癌組織lncRNA NEAT1表達與腫瘤FIGO分期、淋巴結轉移有關。與Chai等[14]體外研究結果一致，提示lncRNA NEAT1可參與卵巢癌形成與惡性進展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1高表達者生存率和生存時間均低于lncRNA NEAT1低表達者，表明lncRNA NEAT1高表達與卵巢癌患者預后不良有關。因此，lncRNA NEAT1有可能成為預測卵巢癌患者預后的指標之一。

CtBP家族因可與E1A蛋白的碳基末端五個氨基酸序列結合而得名，在進化上高度保守，是一類輔助轉錄抑制因子[15]。CtBP家族有多個亞型，CtBP2是其中的重要一員，基因定位于染色體21q21.3[6]。CtBP2的中心結構域可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結合，碳基末端能夠對基因進行翻譯后修飾，氨基末端則可特異性識別并結合特定轉錄抑制因子，三個結構域協(xié)同發(fā)揮輔助轉錄抑制因子功能[16～18]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2還能參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2能夠通過抑制c-Myc信號通路促進前列腺癌細胞增殖；而Takayama等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2還能通過調控雄激素受體活性促進前列腺癌惡性進展；Dai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，過表達CtBP2能夠促進胃癌細胞上皮間質轉化，從而促進腫瘤細胞增殖和侵襲。本研究結果顯示，卵巢癌組織CtBP2相對表達量明顯高于卵巢囊腫組織；卵巢癌組織CtBP2表達與腫瘤FIGO分期、淋巴結轉移有關。與上述文獻[19～21]報道基本一致，提示CtBP2可參與卵巢癌形成和惡性進展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2高表達者生存率和生存時間均低于CtBP2低表達者，表明CtBP2高表達與卵巢癌患者預后不良有關。因此，CtBP2有可能成為預測卵巢癌患者預后的指標之一。

Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1能夠通過調控miR-129/CtBP2軸，增強食管鱗癌細胞活性并促進腫瘤細胞侵襲。本研究結果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織lncRNA NEAT1表達與CtBP2表達呈正相關關系。因此推測，CtBP2可能是lncRNA NEAT1參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的下游基因位點，但其具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，卵巢癌組織lncRNA NEAT1、CtBP2高表達，二者表達變化可能協(xié)同促進腫瘤惡性進展并導致患者預后不良。lncRNA NEAT1、CtBP2有可能成為卵巢癌早期診斷和預后監(jiān)測的生物標志物。